發(fā)布時(shí)間：2017-11-15 06:21

  本文關(guān)鍵詞：Arkadia對(duì)肝纖維化SnoN蛋白降解作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景與目的:肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展成肝硬化及肝功能失代償?shù)墓餐A段,但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明,且總體療效仍不理想。因此需要進(jìn)一步深入探討肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為尋找干預(yù)肝纖維化進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公認(rèn)促肝纖維化最有效、最有力的細(xì)胞因子,Smad信號(hào)是其發(fā)揮作用的主要通路。而Sno N蛋白能阻斷TGF-β1/Smad信號(hào),抑制肝纖維化。我們前期研究發(fā)現(xiàn),不同肝纖維化動(dòng)物模型及病人纖維化肝組織中,Sno N蛋白減少,而Sno N基因轉(zhuǎn)錄水平未改變,可能與泛素化降解Sno N蛋白的關(guān)鍵酶Arkadia有關(guān),但其作用和機(jī)制尚不清楚。因而本研究從體內(nèi)及體外兩方面著手,探Arkadia降解Sno N的分子機(jī)制。本研究將有利于深入闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制。方法:(1)體內(nèi)研究:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水)1周,采用隨機(jī)數(shù)值表法進(jìn)行分組,CCl4(carbon tetrachloride)肝纖維化模型組(model)43只,腹腔注射50%的CCl4橄欖油溶液0.15 ml/100 g體重,2次/周,共8周,8周后停止注射,繼續(xù)飼養(yǎng)4周,建立肝纖維化逆轉(zhuǎn)模型,大鼠分別于第2、4、6、8、10、12周處死;對(duì)照組7只大鼠腹腔注射等量生理鹽水,于第8周一并處死,并留取肝臟標(biāo)本,心臟取血,收集血清。大體標(biāo)本觀察、HE染色、Masson染色和血清生化檢測(cè)確定大鼠肝纖維化模型是否成功,通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)Arkadia、Sno N、FN、TGF-β1、Collagen-Ⅰ、α-SMA等的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)檢測(cè)Arkadia、FN的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)Arkadia、Sno N、FN的表達(dá)。(2)體外研究:用10 ng/ml的TGF-β1刺激肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC),分別在2、6、12、24及48小時(shí)(hour,h)收集細(xì)胞。用不同濃度(0ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml)的TGF-β1刺激HSC細(xì)胞,12h后收集細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光法定位檢測(cè)Arkadia、Sno N、FN的表達(dá)。Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Arkadia、FN的表達(dá)。結(jié)果:大體標(biāo)本觀察、HE染色、Masson染色和血清生化檢測(cè)結(jié)果提示CCl4導(dǎo)致的化學(xué)性肝纖維化大鼠模型及其逆轉(zhuǎn)模型復(fù)制成功;纖維化肝組織中FN等m RNA表達(dá)上調(diào);隨纖維化病程進(jìn)展FN、TGF-β1、Collagen-Ⅰ、α-SMA等表達(dá)增加。Sno N蛋白在肝纖維化組織中表達(dá)減少,Arkadia蛋白則表達(dá)增多。TGF-β1刺激的HSC-T6細(xì)胞中,Arkadia及FN隨著刺激濃度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)逐漸增多,并在濃度為10ng/ml及12h時(shí),表達(dá)最多。結(jié)論:Arkadia蛋白在纖維化肝組織中表達(dá)增多,Sno N蛋白表達(dá)減少。肝纖維化在停止損傷因素后可發(fā)生逆轉(zhuǎn),且Arkadia及Sno N蛋白的表達(dá)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：1188680