本文關(guān)鍵詞：乙肝病毒（HBV）對于肝癌宿主基因組的插入整合及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的:原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界范圍內(nèi)均位居發(fā)病率最為普遍的惡性實(shí)體腫瘤前列,其在全球范圍內(nèi)的癌癥發(fā)病率中高居第五,并且其腫瘤導(dǎo)致的相關(guān)死亡率在所有腫瘤相關(guān)致死率相關(guān)統(tǒng)計(jì)中高居第三。在許多發(fā)展中國家,原發(fā)性肝癌往往在晚期才被診斷出來并且此時(shí)的切除手術(shù)的療效極其有限。原發(fā)性肝癌的發(fā)生率在全球范圍內(nèi)具有顯著的地理分布及人種差異,并且還具有顯著的性別差異存在。相比于白色人種,原發(fā)性肝癌的發(fā)病率及死亡率在亞洲人尤其的高。為我們所熟知的是,在世界范圍內(nèi)尤其在某些特定地區(qū)慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染是密切參與并推進(jìn)原發(fā)性肝癌發(fā)生及進(jìn)一步惡性發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素,在中國,超過80%的肝癌患者均同時(shí)伴有乙型肝炎病毒的感染。研究證實(shí),乙型肝炎病毒的基因組DNA可以整合到宿主基因組中并且被認(rèn)為是乙肝病毒誘發(fā)肝癌的主要原因之一。最近有越來越多的研究證據(jù)提示乙肝病毒對于宿主基因組的整合作用密切參與肝臟腫瘤的發(fā)生。這些乙肝病毒的整合能夠誘導(dǎo)宿主基因拷貝數(shù)變化(CNV),染色體變化,亦或是宿主基因的表達(dá)變化。有研究報(bào)道乙型肝炎病毒更為傾向于整合入宿主腫瘤基因組中的熱點(diǎn)靶向基因TERT,FAR2,MLL4之中。而與此同時(shí)也有其他的研究報(bào)道稱乙型肝炎病毒往往更傾向于整合入相鄰非腫瘤組織基因組的靶向基因FN1和SMAD5之中。.可見之前多篇關(guān)于乙肝病毒整合的研究報(bào)道之間存在較大的爭議,而目前我們也并不知道造成這種差異的內(nèi)在原因是什么。但是,通過比較我們發(fā)現(xiàn)既往相關(guān)研究還是存在較大的不足,其研究隊(duì)列的肝癌樣本數(shù)目較為有限,同時(shí)其檢測乙肝病毒整合的技術(shù)也不夠理想,并且我們認(rèn)為目前發(fā)現(xiàn)的乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌關(guān)鍵基因的檢測還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有系統(tǒng)完成。因此,我們認(rèn)為針對乙肝病毒整合這個(gè)研究方向有必要采取進(jìn)一步努力和探索,不僅為了確認(rèn)既往的調(diào)查結(jié)果,更重要的是,更深入的探索那些重要的乙型肝炎病毒整合易感基因位點(diǎn)。相較于女性,男性患者原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生率顯著更高。最近,大量的研究將重點(diǎn)放在研究性別因素和肝癌發(fā)病率以及其臨床特征之間的內(nèi)在關(guān)系上。Huang et al報(bào)道,乙型肝炎病毒相關(guān)的肝癌中男性比女性具有更高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并且男女患者會(huì)顯示出不同臨床特點(diǎn)。Hou et al報(bào)道,原發(fā)性肝癌不同的性別差異會(huì)使得腫瘤內(nèi)部在分子水平上也各不相同,最終導(dǎo)致截然不同的分子表型。乙型肝炎病毒整合入人類基因組目前被認(rèn)為是原發(fā)性肝癌癌變過程的一種早期事件。然而,目前沒有一項(xiàng)研究報(bào)告將重點(diǎn)關(guān)注在乙肝病毒整合與性別因素的內(nèi)在聯(lián)系上。目前乙型肝炎病毒(HBV)已被鑒定出具有八種基因亞型(A-H)。多個(gè)研究小組報(bào)告,乙肝病毒不同的基因亞型其感染流行分布有明顯的地理差異,并已被證明在臨床療效、患者預(yù)后生存及抗病毒治療反應(yīng)性等多個(gè)方面均存在顯著的不同。在亞洲,最流行的乙型肝炎病毒基因亞型是基因亞型B和C。然而,目前沒有一項(xiàng)研究報(bào)告將重點(diǎn)關(guān)注不同乙肝病毒亞型其基因組整合特性的差異。原發(fā)性肝癌患者絕大多數(shù)均伴有肝臟的肝硬化,但同時(shí)也有一部分肝癌患者并不經(jīng)過長期的肝硬化階段而直接進(jìn)展成瘤。在全球,至少三分之一的肝硬化是由于慢性乙型肝炎所致,并且慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者中顯著一部分最終會(huì)進(jìn)展成為原發(fā)性肝癌。大量研究表明肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之間存在著顯著的臨床和病毒學(xué)特征差異。然而,我們發(fā)現(xiàn)以往的大多數(shù)研究并沒有特別區(qū)分肝癌患者的肝硬化和非肝硬化情況,此外,肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之間的乙型肝炎病毒整合特性差異目前仍然未知。以往關(guān)于乙肝病毒整合的研究多采用southern blot或是傳統(tǒng)PCR技術(shù),其技術(shù)局限性也很大程度上制約了以往研究的發(fā)現(xiàn),使其無法系統(tǒng)全面的解析宿主基因組中乙肝病毒的整合斷點(diǎn)。在乙型肝炎病毒基因組中含有大量的突變,這會(huì)導(dǎo)致PCR檢測失敗。即便使用全基因組測序技術(shù)(WGS),乙型肝炎病毒整合斷點(diǎn)的檢測的靈敏度其實(shí)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想的程度。為了解決實(shí)際的技術(shù)問題,我們的研究參與人員已經(jīng)開發(fā)了一種全新的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法,即高通量乙肝病毒整合靶向檢測技術(shù)(HIVID)。通過實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,對于識別乙肝病毒整合位點(diǎn)這種全新的靶向檢測技術(shù)比全基因組測序方法(WGS)更為靈敏。為了解決上述種種關(guān)于乙肝病毒整合的科學(xué)問題并進(jìn)一步理解乙肝病毒整合參與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體影響機(jī)制,我們系統(tǒng)收集了在我院進(jìn)行肝癌切除手術(shù)的426例病人的配對腫瘤和相鄰非腫瘤對照組織,提取其基因組后進(jìn)行了HIVID的檢測。研究入組的426例病毒均經(jīng)過嚴(yán)格的臨床和病理學(xué)驗(yàn)證證實(shí)其為原發(fā)性肝癌肝細(xì)胞型。并且我們隨機(jī)選擇12個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序(RNA seq),以進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄水平的變化。本研究旨在探討乙肝病毒整合在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制,加深我們對于乙肝病毒整合作為肝癌惡性轉(zhuǎn)化及浸潤重要作用的了解,為今后乙肝病毒整合研究成果向臨床進(jìn)一步應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供重要的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:(1)我們系統(tǒng)了收集426例臨床肝癌病人的肝癌及癌旁組織樣本進(jìn)行HIVID檢測,以系統(tǒng)全面研究乙肝病毒HBV在肝癌及癌旁組織基因組中的整合特性及其分布。(2)HIVID技術(shù)方法驗(yàn)證:通過隨機(jī)方法挑選出了檢測到的60個(gè)整合斷點(diǎn)進(jìn)行PCR以及Sanger測序驗(yàn)證。(3)通過肝癌腫瘤及癌旁組織分組進(jìn)行斷點(diǎn)整合譜差異比較。(4)研究全新發(fā)現(xiàn)的高頻乙肝病毒整合基因轉(zhuǎn)錄組水平功能變化:實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(realtime-PCR)。(5)研究全新發(fā)現(xiàn)的高頻乙肝病毒整合基因蛋白水平功能變化:免疫組化染色實(shí)驗(yàn)(IHC)。(6)研究在腫瘤組織中乙肝病毒整合對于其特異性富集信號通路m TOR signaling pathway蛋白水平功能變化:免疫組化染色實(shí)驗(yàn)(IHC)。(7)研究腫瘤組織內(nèi)乙肝病毒整合在轉(zhuǎn)錄組水平上的保留及其功能變化:隨機(jī)挑選了12個(gè)含有HBV病毒整合的腫瘤組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)實(shí)驗(yàn)。(8)研究HBV-DNA在體內(nèi)的復(fù)制與其整合特性內(nèi)在相關(guān)性:HBV-DNA檢測試劑COBAS。(9)研究病毒整合的克隆性問題以及驗(yàn)證HIVID檢測出的HBV整合斷點(diǎn)的可靠性及靈敏性:選取了10個(gè)同時(shí)具備HIVID及RNA-seq數(shù)據(jù)的患者的腫瘤組織進(jìn)行了全基因組測序(WGS)。(10)研究乙肝病毒整合與原發(fā)性肝癌臨床特征之間的內(nèi)在相關(guān)性及差異:HBV B型VS HBV C型乙肝病毒整合差異,肝硬化肝癌VS非肝硬化肝癌乙肝病毒整合差異,男性患者肝癌VS女性患者肝癌乙肝病毒整合差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)在腫瘤組織中一共發(fā)現(xiàn)了3486個(gè)HBV病毒整合斷點(diǎn),而在對應(yīng)的癌旁組織中739個(gè)HBV病毒整合斷點(diǎn)。HBV病毒的總體整合率為76.9%。配對的癌旁對照組織中,HBV病毒的整合率則僅為37.3%。(2)在60個(gè)隨機(jī)挑選的斷點(diǎn)中成功驗(yàn)證出52個(gè)整合斷點(diǎn)存在,并且序列一致,總體驗(yàn)證率為86.7%。(3)HBV病毒在肝癌宿主的腫瘤組織及癌旁組織基因組中的整合分布及整合特性是具有較為顯著的差異。在腫瘤組織中,HBV病毒可見高頻整合于TERT,KMT2B,CCNE1等一系列基因,在癌旁對照組織中,HBV病毒則高頻整合于FN1,PTPRN2及TERT等一系列基因中。(4)在腫瘤組織中,HBV病毒整合靶向基因在m TOR signaling pathway癌癥相關(guān)通路上有所富集。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),HBV病毒的整合可以影響m TOR信號通路在蛋白水平的激活狀態(tài)。(5)針對腫瘤及癌旁組織中發(fā)現(xiàn)全新的高頻HBV病毒靶向整合基因包括:PTPRD、UNC5D、NRG3、CTNND2、AHRR,通過IHC及realtime-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),HBV病毒整合可以影響這些靶向基因m RNA及蛋白水平表達(dá)。(6)在轉(zhuǎn)錄組水平,HBV整合片段在RNA水平在位于1500---1900bp的區(qū)域呈現(xiàn)出顯著的富集現(xiàn)象,此區(qū)域與DNA水平所發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。(7)HBV B型及HBV C型乙肝病毒在樣本整合率等一系列整合特性上具有顯著差異。(8)患者血清中HBV-DNA滴度與其基因組中的發(fā)現(xiàn)的整合斷點(diǎn)數(shù)之間并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。(9)單一患者同一瘤體內(nèi)的多數(shù)肝癌細(xì)胞均為單克隆起源。多數(shù)HBV病毒片段在宿主肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的整合發(fā)生在腫瘤形成的早期階段。(10)男性及女性原發(fā)性肝癌患者腫瘤組織中乙肝病毒整合特性上具有顯著的性別差異。(11)肝硬化肝癌與非肝硬化肝癌中乙肝病毒整合譜具有顯著差異。結(jié)論:通過本研究,我們首次采用大樣本量隊(duì)列以及更為靈敏的技術(shù)方法系統(tǒng)深入的解析了乙肝相關(guān)原發(fā)性肝癌腫瘤及癌旁組織中乙肝病毒的整合特性。我們的研究發(fā)現(xiàn),在宿主基因組的基因富集區(qū)等特定重要區(qū)域以及一部分基因組重要關(guān)鍵位點(diǎn)上,乙肝病毒具有顯著的整合偏好性。我們認(rèn)為,乙肝病毒在宿主基因組上關(guān)鍵位點(diǎn)的整合使得肝細(xì)胞具有惡性轉(zhuǎn)化的潛能,密切參與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的過程。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62;R735.7

【引證文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳杭航;黃天壬;鄧偉;方向;任靜靜;甘膺元;;廣西肝癌高發(fā)區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌HBV X基因的整合及影響因素分析[J];中國癌癥防治雜志;2017年03期

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本文編號：1181009