本文關(guān)鍵詞：肝刺激因子敲減通過抑制線粒體融合影響非酒精性脂肪性肝炎的研究

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【摘要】：背景與目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指患者并無過量飲酒史,而由其他原因引起的類似于酒精性脂肪肝的肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥的一類肝臟代謝綜合征。NAFLD在臨床病理上分為三個(gè)階段,單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),肝纖維化和肝硬化,甚至最終發(fā)展為肝癌。目前認(rèn)為,處于第一階段的單純性脂肪肝尚可已通過改變生活方式和飲食習(xí)慣來治療,而一旦進(jìn)入到NASH這一關(guān)鍵環(huán)節(jié),則由于缺乏有效藥物,難以徹底根治。因此,研究NASH的分子機(jī)制對疾病的預(yù)防具有至關(guān)重要的意義。肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)是1975年在初斷乳的大鼠肝臟發(fā)現(xiàn)并提取的一種活性物質(zhì),具有特異性刺激活化狀態(tài)下肝細(xì)胞增殖的特性,其基因名稱為生長因子ERV1樣基因(growth factor erv1-like gene,Gfer)。HSS可以保護(hù)肝細(xì)胞免受諸如CCl4,半乳糖胺等毒物所造成的損傷,同時(shí)還具有促進(jìn)肝再生的作用。研究顯示,外源注射HSS表達(dá)載體可以減輕小鼠肝臟脂肪變性,使NASH進(jìn)程放緩。與之對應(yīng),降低小鼠肝臟內(nèi)HSS的表達(dá)是否可以加快NASH進(jìn)程。人們不禁要問,HSS是通過何種機(jī)制使NASH病情加重,迄今尚無定論。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用我室繁育的HSS敲減型C57BL/6小鼠(Gfer+/-,即穩(wěn)定低表達(dá)HSS的小鼠),依此復(fù)制NASH模型,探討HSS表達(dá)下降對NASH發(fā)生發(fā)展的影響,并研究其中的分子機(jī)制,從而為NASH的預(yù)防及治療提供新的分子靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法:1、選取體重20-25 g的Gfer+/+與Gfer+/-C57BL/6小鼠,喂食含60%高脂的膽堿缺乏飲食(choline-deficient diet,CD diet),在第1 w的飲水中添加乙硫氨酸(終濃度為0.165%),自由飲用,第2 w即恢復(fù)正常飲水,持續(xù)喂養(yǎng)4 w和8 w,制備NASH小鼠模型。2、兩組不同基因型小鼠分別于造模4 w和8 w后取血,分離血清后測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量。3、取血后的小鼠斷頸處死,分離肝臟,取部分肝組織石蠟包埋,切片后分別進(jìn)行HE染色、Masson染色和天狼猩紅染色,以觀察肝臟病理改變及膠原沉積情況;部分肝組織用OCT包埋,切片后進(jìn)行油紅O染色以評價(jià)肝組織內(nèi)脂質(zhì)含量;再有部分肝組織經(jīng)戊二醛固定,制備電鏡樣品,以觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。4、提取肝組織總DNA,利用Real-time PCR方法分析線粒體DNA(mt DNA)占細(xì)胞總DNA的相對值。5、提取肝組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄后采用Real-time PCR方法檢測HSS,PGC-1α,TFAM,ATPs,COXIV,Drp1,Fis1,Mfn1,Mfn2,Atg7等基因在兩組小鼠肝組織內(nèi)的表達(dá)情況。6、提取肝組織總蛋白質(zhì),利用Western blot方法進(jìn)一步分析上述基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化,以驗(yàn)證Real-time PCR的結(jié)果。7、利用試劑盒分別檢測肝組織內(nèi)丙二醛(malondialdehyde,MDA)和ATP的含量。8、分離肝組織的線粒體,分析呼吸鏈復(fù)合物V和細(xì)胞色素C氧化酶活性,并檢測線粒體膜電位的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示,Gfer+/-小鼠肝組織中HSS的表達(dá)量,無論在m RNA水平,還是蛋白質(zhì)水平,均明顯低于Gfer+/+組,說明我們繁育的Gfer+/-小鼠基因型鑒定正確可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。2、NASH造模4 w和8 w時(shí),Gfer+/+和Gfer+/-小鼠血清中的ALT,AST,ALB和TG的含量無明顯差異,但Gfer+/-小鼠血清中TC含量明顯低于Gfer+/+小鼠,提示肝功能出現(xiàn)損害,脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂。3、HE染色、油紅O染色和Masson染色結(jié)果顯示,造模4 w時(shí),Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)脂肪沉積及炎癥較Gfer+/+小鼠更為嚴(yán)重。造模8 w時(shí),雖然Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)脂肪沉積輕于Gfer+/+小鼠,但炎癥及膠原沉積明顯重于Gfer+/+小鼠,提示:肝組織病變向纖維化階段進(jìn)展。4、電鏡下觀察肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)造模4 w和8 w時(shí),Gfer+/-小鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目明顯多于Gfer+/+小鼠,而且線粒體的面積增大,形狀趨向橢圓。5、Real-time PCR及Western blot結(jié)果顯示,造模4 w和8 w時(shí),Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)線粒體融合相關(guān)基因(例如Mfn1和Mfn2)的表達(dá)明顯低于Gfer+/+小鼠,與自噬相關(guān)的Atg7的表達(dá)同樣明顯低于Gfer+/+小鼠,提示線粒體動態(tài)(mitochondrial dynamics)發(fā)生改變,融合出現(xiàn)障礙。6、Real-time PCR結(jié)果顯示,造模4 w和8 w時(shí),Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)mt DNA與n DNA的相對含量明顯低于Gfer+/+小鼠;與mt DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PGC-1α和TFAM的表達(dá)同樣明顯低于Gfer+/+小鼠;由mt DNA轉(zhuǎn)錄并翻譯的ATP合酶(ATPs)和細(xì)胞色素c氧化酶IV(Cox-IV)的表達(dá)也隨之降低;與之對應(yīng),Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)呼吸鏈復(fù)合物V和細(xì)胞色素C氧化酶活性減弱,線粒體膜電位降低。7、Gfer+/-小鼠肝組織內(nèi)ATP的含量明顯低于Gfer+/+小鼠,而MDA的含量明顯高于Gfer+/+小鼠。結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)室制備并繁殖的Gfer+/-小鼠,其組織內(nèi)HSS含量穩(wěn)定降低,可應(yīng)用于疾病模型的構(gòu)建以研究HSS的功能。2、HSS表達(dá)下降,抑制線粒體融合,使線粒體生物生成出現(xiàn)障礙,造成線粒體呼吸鏈功能異常,脂肪酸氧化受到抑制,從而加重NASH的病程。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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1 Yaffe M;Schatz G;楊劍;;線粒體研究展望[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1987年02期

2 楊青;線粒體蛋白質(zhì)是如何進(jìn)入線粒體的[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊;1987年02期

3 Schatz G;Butow RA;王靜;;蛋白質(zhì)如何輸入線粒體[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1984年01期

4 鄭斌嬌;梁敏;薛凌;鄭靜;張婷;龔莎莎;方芳;呂建新;管敏鑫;;線粒體相關(guān)的疾病治療及干預(yù)策略[J];生命科學(xué);2012年02期

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本文編號：1171817