本文關鍵詞：肝刺激因子敲減通過抑制線粒體融合影響非酒精性脂肪性肝炎的研究

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【摘要】：背景與目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指患者并無過量飲酒史,而由其他原因引起的類似于酒精性脂肪肝的肝細胞脂肪變性和炎癥的一類肝臟代謝綜合征。NAFLD在臨床病理上分為三個階段,單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),肝纖維化和肝硬化,甚至最終發(fā)展為肝癌。目前認為,處于第一階段的單純性脂肪肝尚可已通過改變生活方式和飲食習慣來治療,而一旦進入到NASH這一關鍵環(huán)節(jié),則由于缺乏有效藥物,難以徹底根治。因此,研究NASH的分子機制對疾病的預防具有至關重要的意義。肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)是1975年在初斷乳的大鼠肝臟發(fā)現(xiàn)并提取的一種活性物質,具有特異性刺激活化狀態(tài)下肝細胞增殖的特性,其基因名稱為生長因子ERV1樣基因(growth factor erv1-like gene,Gfer)。HSS可以保護肝細胞免受諸如CCl4,半乳糖胺等毒物所造成的損傷,同時還具有促進肝再生的作用。研究顯示,外源注射HSS表達載體可以減輕小鼠肝臟脂肪變性,使NASH進程放緩。與之對應,降低小鼠肝臟內HSS的表達是否可以加快NASH進程。人們不禁要問,HSS是通過何種機制使NASH病情加重,迄今尚無定論。本實驗應用我室繁育的HSS敲減型C57BL/6小鼠(Gfer+/-,即穩(wěn)定低表達HSS的小鼠),依此復制NASH模型,探討HSS表達下降對NASH發(fā)生發(fā)展的影響,并研究其中的分子機制,從而為NASH的預防及治療提供新的分子靶點。實驗方法:1、選取體重20-25 g的Gfer+/+與Gfer+/-C57BL/6小鼠,喂食含60%高脂的膽堿缺乏飲食(choline-deficient diet,CD diet),在第1 w的飲水中添加乙硫氨酸(終濃度為0.165%),自由飲用,第2 w即恢復正常飲水,持續(xù)喂養(yǎng)4 w和8 w,制備NASH小鼠模型。2、兩組不同基因型小鼠分別于造模4 w和8 w后取血,分離血清后測定血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量。3、取血后的小鼠斷頸處死,分離肝臟,取部分肝組織石蠟包埋,切片后分別進行HE染色、Masson染色和天狼猩紅染色,以觀察肝臟病理改變及膠原沉積情況;部分肝組織用OCT包埋,切片后進行油紅O染色以評價肝組織內脂質含量;再有部分肝組織經(jīng)戊二醛固定,制備電鏡樣品,以觀察肝細胞超微結構的改變。4、提取肝組織總DNA,利用Real-time PCR方法分析線粒體DNA(mt DNA)占細胞總DNA的相對值。5、提取肝組織總RNA,反轉錄后采用Real-time PCR方法檢測HSS,PGC-1α,TFAM,ATPs,COXIV,Drp1,Fis1,Mfn1,Mfn2,Atg7等基因在兩組小鼠肝組織內的表達情況。6、提取肝組織總蛋白質,利用Western blot方法進一步分析上述基因在蛋白質水平的表達變化,以驗證Real-time PCR的結果。7、利用試劑盒分別檢測肝組織內丙二醛(malondialdehyde,MDA)和ATP的含量。8、分離肝組織的線粒體,分析呼吸鏈復合物V和細胞色素C氧化酶活性,并檢測線粒體膜電位的改變。實驗結果:1、Real-time PCR及Western blot結果顯示,Gfer+/-小鼠肝組織中HSS的表達量,無論在m RNA水平,還是蛋白質水平,均明顯低于Gfer+/+組,說明我們繁育的Gfer+/-小鼠基因型鑒定正確可用于后續(xù)實驗中。2、NASH造模4 w和8 w時,Gfer+/+和Gfer+/-小鼠血清中的ALT,AST,ALB和TG的含量無明顯差異,但Gfer+/-小鼠血清中TC含量明顯低于Gfer+/+小鼠,提示肝功能出現(xiàn)損害,脂質代謝出現(xiàn)紊亂。3、HE染色、油紅O染色和Masson染色結果顯示,造模4 w時,Gfer+/-小鼠肝組織內脂肪沉積及炎癥較Gfer+/+小鼠更為嚴重。造模8 w時,雖然Gfer+/-小鼠肝組織內脂肪沉積輕于Gfer+/+小鼠,但炎癥及膠原沉積明顯重于Gfer+/+小鼠,提示:肝組織病變向纖維化階段進展。4、電鏡下觀察肝細胞的超微結構,發(fā)現(xiàn)造模4 w和8 w時,Gfer+/-小鼠肝細胞內線粒體數(shù)目明顯多于Gfer+/+小鼠,而且線粒體的面積增大,形狀趨向橢圓。5、Real-time PCR及Western blot結果顯示,造模4 w和8 w時,Gfer+/-小鼠肝組織內線粒體融合相關基因(例如Mfn1和Mfn2)的表達明顯低于Gfer+/+小鼠,與自噬相關的Atg7的表達同樣明顯低于Gfer+/+小鼠,提示線粒體動態(tài)(mitochondrial dynamics)發(fā)生改變,融合出現(xiàn)障礙。6、Real-time PCR結果顯示,造模4 w和8 w時,Gfer+/-小鼠肝組織內mt DNA與n DNA的相對含量明顯低于Gfer+/+小鼠;與mt DNA復制、轉錄相關的PGC-1α和TFAM的表達同樣明顯低于Gfer+/+小鼠;由mt DNA轉錄并翻譯的ATP合酶(ATPs)和細胞色素c氧化酶IV(Cox-IV)的表達也隨之降低;與之對應,Gfer+/-小鼠肝組織內呼吸鏈復合物V和細胞色素C氧化酶活性減弱,線粒體膜電位降低。7、Gfer+/-小鼠肝組織內ATP的含量明顯低于Gfer+/+小鼠,而MDA的含量明顯高于Gfer+/+小鼠。結論:1、本實驗室制備并繁殖的Gfer+/-小鼠,其組織內HSS含量穩(wěn)定降低,可應用于疾病模型的構建以研究HSS的功能。2、HSS表達下降,抑制線粒體融合,使線粒體生物生成出現(xiàn)障礙,造成線粒體呼吸鏈功能異常,脂肪酸氧化受到抑制,從而加重NASH的病程。
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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2 楊青;線粒體蛋白質是如何進入線粒體的[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;1987年02期

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本文編號：1171817