本文關(guān)鍵詞：Slingshot介導的Cofilin活化在缺氧腸上皮細胞屏障功能損害中的作用與機制研究

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【摘要】：長期以來,腸道被認為是嚴重燒創(chuàng)傷等外科應激的中心器官。燒傷后由于屏障功能損害所引起的機體病理生理紊亂已得到廣泛認可,但其具體機制尚未完全清楚。本課題組既往研究表明,嚴重燒傷或缺血缺氧時腸上皮屏障功能損害與細胞緊密連接(Tight junction,TJ)相關(guān)蛋白以及F-肌動蛋白(F-actin)等有關(guān),但分子機制仍不清楚。絲切蛋白(Cofilin)是一種重要的肌動蛋白(Actin)結(jié)合蛋白,在細胞骨架肌動蛋白的聚合與解聚動態(tài)平衡的調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用,而Cofilin活性又直接受到其上游信號分子Slingshot(SSH)的調(diào)控。研究表明,SSH家族蛋白引起Cofilin去磷酸化而激活Cofilin,從而調(diào)控細胞骨架肌動蛋白聚合與解聚的動態(tài)平衡。嚴重燒傷早期損害的實質(zhì)其實就是缺血缺氧性損害。因此,我們假設嚴重燒傷早期的缺血缺氧通過誘導SSH表達而引起腸上皮細胞Cofilin活化,導致細胞骨架肌動蛋白的聚合與解聚平衡失調(diào),進一步引起緊密連接蛋白的變化,從而導致腸上皮屏障功能損害。據(jù)此,本課題擬通過體外實驗建立單層腸上皮細胞模型,研究缺氧條件下腸上皮細胞SSH/Cofilin/F-actin通路的變化及其在嚴重燒傷早期腸上皮屏障功能損害中的作用,進而闡明其分子機制。一、方法1.常規(guī)培養(yǎng)人腸上皮細胞株Caco-2,將Caco-2細胞種植于Transwell聚碳酸酯膜,建立單層腸上皮細胞模型。將單層Caco-2細胞在1%O2環(huán)境條件下進行缺氧處理,缺氧時間分別為0、1、2、6、12及24h;另將單層Caco-2細胞分別用Jasplakinolide與Lat A進行處理,處理時間分別為0、1、2、6、12及24h。2.采用生物電阻測定儀檢測跨上皮細胞電阻(TER),以反映單層腸上皮細胞屏障功能的完整性;用FITC-dextran示蹤法檢測單層腸上皮細胞通透性的變化。3.采用熒光法檢測單層腸上皮細胞F-actin的分布以及F-actin/G-actin含量比值的變化。4.用間接免疫熒光法檢測單層腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1及Occludin分布的變化,并用Western blot法檢測單層腸上皮細胞ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達的變化。5.采用Western blot法分別檢測單層腸上皮細胞Cofilin、p-cofilin、SSH-1、SSH-2及SSH-3蛋白表達的變化。二、結(jié)果1.缺氧引起單層腸上皮細胞TER明顯下降。2.缺氧后單層腸上皮細胞纖維狀肌動蛋白形態(tài)分布明顯改變,F-actin/G-actin含量比值明顯降低。3.缺氧單層腸上皮細胞Cofilin蛋白表達在各時相點均無明顯變化,而磷酸化cofilin蛋白表達顯著降低。4.缺氧引起單層腸上皮細胞ZO-1、Occludin以及Claudin-1蛋白表達明顯降低,并引起ZO-1與Occludin分布明顯改變。5.缺氧對單層腸上皮細胞Slingshot-1、Slingshot-3蛋白表達無明顯影響,但引起Slingshot-2蛋白表達明顯升高。6.Jasplakinolide和Lat A均可引起單層腸上皮細胞TER明顯下降,通透性顯著增加。7.Jasplakinolide和Lat A均可引起單層腸上皮細胞ZO-1與Occludin蛋白表達明顯降低,并引起ZO-1與Occludin分布明顯改變。8.Jasplakinolide引起單層腸上皮細胞F-actin/G-actin比值明顯升高,尤其在24h升高顯著;而Lat A則引起單層腸上皮細胞F-actin/G-actin比值在24h有較明顯的降低。9.Jasplakinolide和Lat A處理后,單層腸上皮細胞Cofilin蛋白表達在各時相點均無明顯變化,而p-cofilin蛋白表達顯著降低。三、結(jié)論缺氧后單層腸上皮細胞屏障功能損害明顯,其分子機制可能是缺氧通過誘導Slingshot-2蛋白表達,激活Cofilin,引起F-actin解聚以及F-actin與G-actin平衡失調(diào),從而導致TJ蛋白表達降低及分布改變。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 腸上皮細胞 屏障功能 通透性 絲切蛋白 Slingshot 纖維狀肌動蛋白 球狀肌動蛋白 緊密連接蛋白 Jasplakinolide Latruculin A
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 缺氧對腸上皮細胞Slingshot介導的Cofilin活化的影響及其與屏障功能損害的關(guān)系13-36
• 2.1 材料與方法13-21
• 2.2 實驗結(jié)果21-33
• 2.3 討論33-36
• 第三章 肌動蛋白變化在腸上皮細胞屏障功能損害中的作用36-51
• 3.1 材料與方法36-37
• 3.2 實驗結(jié)果37-49
• 3.3 討論49-51
• 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻52-55
• 文獻綜述 絲切蛋白與疾病關(guān)系的研究進展55-66
• 參考文獻61-66
• 攻讀學位期間的研究成果66-67
• 致謝67

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 石辛甫,高杰英;腸上皮間淋巴細胞的研究進展[J];免疫學雜志;1998年04期

2 曾小川，，汪維偉;胚胎腸上皮的組織發(fā)生機制之研究進展[J];重慶醫(yī)科大學學報;1998年03期

3 Trier J S ,楊希山;腸M細胞的結(jié)構(gòu)和功能[J];國外醫(yī)學(消化系疾病分冊);1992年03期

4 周靜,王杉,葉穎江,楊q

本文編號：1130240