本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高果糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成中的作用

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【摘要】：非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指非酒精所致(每日飲酒量小于10克),以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變,其發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢(shì)。NAFLD疾病譜隨病程的進(jìn)展而表現(xiàn)不一,包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌,大部分患者僅為單純性脂肪肝,也簡(jiǎn)稱為“脂肪肝”。脂質(zhì)合成增多、脂肪酸代謝和運(yùn)輸障礙、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)、線粒體功能異常等是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制,而其病理基礎(chǔ)是肝細(xì)胞脂肪變性。當(dāng)肝臟脂質(zhì)合成增加和細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平升高,超過(guò)了脂肪酸的利用(β氧化能力)及極低密度脂蛋白(VLDL)的輸出水平時(shí),過(guò)多的甘油三酯(TG)聚集,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)沉積形成肝細(xì)胞脂肪變性。正常情況下,由乙酰輔酶A從頭合成產(chǎn)生的TG僅為總合成TG的5%,在病理狀態(tài)下,肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成產(chǎn)生的TG可以達(dá)到三分之一。因此,脂質(zhì)從頭合成增多是導(dǎo)致NAFLD脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制。在真核細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及其質(zhì)量監(jiān)控的重要細(xì)胞器。在缺氧、高脂等環(huán)境時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或是錯(cuò)誤折疊蛋白增多,激活細(xì)胞的保護(hù)性措施未折疊蛋白反應(yīng)(unrolded protein response,UPR),當(dāng)適應(yīng)性機(jī)制仍不能有效清除未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白,超出負(fù)荷時(shí)則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS有三條途徑分別為PKR樣ER調(diào)節(jié)激酶[pancreatic ER kinase(PKR)-like ER kinase,PERK又稱雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶]/真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子-2α(eukaryotic initiation factor-2α,e IF-2α)/活化轉(zhuǎn)錄因子-4(activating transcription factor 4,ATF-4)通路,肌醇需酶-1[(inositol requiring enzyme-1,IRE-1)又稱抑制物阻抗性酯酶-1]/X盒結(jié)合蛋白(X-Binding protein-1,XBP-1)和活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activating transcription factor-6,ATF-6),最近研究發(fā)現(xiàn)ERS與糖脂代謝密切相關(guān),可能是導(dǎo)致NAFLD脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制。隨著上世紀(jì)70年代高果糖玉米糖漿(HFCS)引入食品加工業(yè)后,含果糖的食品和軟飲料攝入量增加,臨床和動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)高果糖攝入與人群的肥胖、血脂異常、代謝綜合征、NAFLD相關(guān)。由于高脂飲食是已知的導(dǎo)致NAFLD的重要誘因,我們課題組之前采用高果糖或高脂飲食喂養(yǎng)大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均可誘發(fā)肝內(nèi)脂質(zhì)沉積和高甘油三脂血癥,也證實(shí)短期(1周)和長(zhǎng)期(16周)高果糖喂養(yǎng)均可誘導(dǎo)出小鼠NAFLD模型,出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積,增加了小鼠肝臟內(nèi)源性脂質(zhì)合成率,促進(jìn)脂質(zhì)從頭合成,上調(diào)參與脂質(zhì)從頭合成的上游調(diào)控因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein,Ch REBP)及三個(gè)關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和硬脂酰Co A脫飽和酶-1(stearoyl-Co A desaturase-1,SCD-1),高脂飲食也可以引起肝臟脂質(zhì)沉積,但是對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響則與高果糖飲食相反,并且高果糖飲食導(dǎo)致ERS出現(xiàn),因此前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示ERS可能介導(dǎo)高果糖誘導(dǎo)NAFLD脂質(zhì)從頭合成增加的重要機(jī)制。近來(lái)已有大量的文獻(xiàn)證實(shí)了果糖可以導(dǎo)致脂肪肝,并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)或牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholate,TUDCA)可以改善肝臟脂質(zhì)沉積,單獨(dú)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑可以導(dǎo)致細(xì)胞TG升高,而另有研究發(fā)現(xiàn)高脂環(huán)境可導(dǎo)致ERS,因此ERS和脂質(zhì)從頭合成之間的相互關(guān)系及果糖促脂質(zhì)從頭合成增加的始動(dòng)機(jī)制尚不明確。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)敲低PERK小鼠可避免高脂環(huán)境誘導(dǎo)的NAFLD,敲低XBP-1可以改善小鼠脂肪肝�？墒怯捎趧�(dòng)物研究存在多種干擾因素,目前的研究尚缺乏細(xì)胞水平的對(duì)ERS單條通路在高果糖誘導(dǎo)NAFLD作用機(jī)制中的研究。因此,本研究首先應(yīng)用高果糖(fructose)或高棕櫚酸(palmitic acid,PA)培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞,觀察細(xì)胞甘油三酯(TG)含量、細(xì)胞脂質(zhì)沉積,其次觀察了果糖和棕櫚酸對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響;再分別應(yīng)用兩種ERS抑制劑和兩種ERS誘導(dǎo)劑,觀察ERS對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響,探討ERS對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響;最后分別利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法靶向上調(diào)和下調(diào)PERK/e IF-2α/ATF-4通路中的ATF-4和IRE-1/XBP-1通路中的XBP-1,觀察單條通路對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成的影響,從而在體外細(xì)胞水平研究高果糖飲食對(duì)脂代謝的危害,探討ERS中單條通路在NAFLD發(fā)生機(jī)制中作用。第一部分果糖和棕櫚酸對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成中的不同影響目的:探討果糖和棕櫚酸(palmitic acid,PA)對(duì)Hep G2細(xì)胞甘油三酯的影響及機(jī)制,并確立高果糖造成NAFLD的細(xì)胞模型。方法:采用普通培養(yǎng)基和不同濃度(1、5、20mmol/L)果糖培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞(分別簡(jiǎn)稱為N、F1、F5、F20組),干預(yù)不同時(shí)間(12、24、48、72h)后觀察Hep G2細(xì)胞TG水平和脂質(zhì)沉積,采用GPO-PAP法測(cè)定TG,油紅O染色反應(yīng)脂質(zhì)沉積;再使用普通培養(yǎng)基(N組)、20mmol/L果糖干預(yù)72h(簡(jiǎn)稱F組)或0.2mmol/L棕櫚酸干預(yù)24h(簡(jiǎn)稱PA組),測(cè)定各組肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成相關(guān)的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和Ch REBP的基因表達(dá)水平及三個(gè)下游關(guān)鍵酶ACC、FAS和SCD-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1不同濃度果糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)Hep G2細(xì)胞TG水平的影響:應(yīng)用果糖培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞12小時(shí),F20組的TG水平明顯高于N組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),F1和F5組與N組比較,有升高趨勢(shì),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)24小時(shí)F20組的TG水平明顯高于N組(P0.01),F5組的TG水平明顯高于N組(P0.05)、F1組有升高趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)48或72小時(shí),F5、F20組的TG水平明顯高于N組(均P0.01),F1組較N組有升高趨勢(shì),但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P0.05),提示干預(yù)時(shí)間相同,TG隨果糖濃度增加而增加,呈劑量依賴關(guān)系;果糖濃度相同,TG的水平隨著干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,呈時(shí)間依賴關(guān)系,20mmol/L的果糖,干預(yù)72小時(shí)TG達(dá)到最高值。2不同濃度的果糖培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:油紅O染色顯示N組少見(jiàn)紅染,被油紅染色的大小不一的脂滴隨著果糖濃度增加而增加,F20組紅染脂滴最多。3果糖和棕櫚酸對(duì)細(xì)胞TG水平的影響:F和PA組的肝細(xì)胞TG均較與N組升高(均P0.01),兩組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。4果糖和棕櫚酸對(duì)脂質(zhì)從頭合成上游調(diào)控因子和關(guān)鍵酶的影響:F組比N組的肝內(nèi)Ch REBP基因表達(dá)增加1 8倍(P0.01),PA組無(wú)明顯變化,F組比N組的肝內(nèi)SREBP-1c基因表達(dá)增加5倍(P0.01),PA組比N組的肝內(nèi)SREBP-1c基因表達(dá)增加2.4倍(P0.01),比F組明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);F組比N組的肝內(nèi)ACC、FAS、SCD-1蛋白表達(dá)明顯增加(均P0.05),PA組與N組相比無(wú)顯著差異。結(jié)論:1高果糖培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞可以引起肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積;2肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積程度與果糖的濃度呈劑量依賴性關(guān)系,與干預(yù)時(shí)間呈時(shí)間依賴關(guān)系,20mmol/L的果糖濃度孵育72小時(shí)TG水平達(dá)到最高值,肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積最明顯,確定了果糖的干預(yù)濃度為20mmol/L孵育時(shí)間為72小時(shí);3高棕櫚酸培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞引起脂質(zhì)沉積程度與高果糖一致;4高果糖干預(yù)比高棕櫚酸,明顯促進(jìn)了Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成相關(guān)的上游調(diào)控因子SREBP-1c、Ch REBP和下游關(guān)鍵酶ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平。第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響研究目的:分別使用兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA、TUDCA干預(yù)高果糖培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞,并分別使用兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicamycin、Thapsigagin干預(yù)Hep G2細(xì)胞,觀察ERS對(duì)肝臟內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成的影響。方法:首先分別加入兩種不同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(20mmol/L,簡(jiǎn)稱4-PBA組)、TUDCA(0.2mmol/L,簡(jiǎn)稱TUDCA組)干預(yù)高果糖培養(yǎng)基的Hep G2細(xì)胞,之后分別加入兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicamycin(2μg/ml,簡(jiǎn)稱為T(mén)m組)和Thapsigagin(600nmol/L,簡(jiǎn)稱Tg組)誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞;最后利用Western的方法測(cè)定各組p-PERK、p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4、p-IRE-1/IRE-1和XBP-1s,測(cè)定TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積,檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,以及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類(lèi)ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。結(jié)果:1觀察ERS抑制劑對(duì)ERS的影響:F組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明顯升高(均P0.01),TUDCA組p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4均表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),4-PBA組p-PERK、p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4均表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),兩種抑制劑確實(shí)減少了PERK/e IF-2α/ATF-4和IRE-1/XBP-1的兩條通路蛋白表達(dá);2觀察ERS抑制劑對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:TUDCA組TG減少了40%(P0.01),油紅O染色顯示較F組脂滴明顯減少,4-PBA組減少50%(P0.01),油紅O染色顯示4-PBA組較F20組脂滴明顯減少;3觀察ERS抑制劑對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:TUDCA組較F組SREBP-1c降低了20%(P0.01),Ch REBP降低了15%(P0.05),ACC、FAS、SCD-1表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),4-PBA組較F組SREBP-1c降低了40%(P0.01),Ch REBP降低了42%(P0.05),ACC降低了33%(P0.05)、FAS、SCD-1下降了28%和25%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);4觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)ERS的影響:Tg組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),Tm組較N組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);5觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:Tg刺激后較N組TG升高了200%(P0.01),Tm刺激后較N組TG升高為180%(P0.05),油紅O染色顯示的Tg和Tm組培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞脂滴明顯增多;6觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:與N組比較,Tg組SREBP-1c、Ch REBP表達(dá)增加(均P0.01),FAS表達(dá)增加(P0.01),ACC和SCD-1表達(dá)增加(均P0.05),與N組比較,Tm組SREBP-1c、Ch REBP表達(dá)增加(均P0.01),FAS、ACC和SCD-1表達(dá)增加(均P0.01)。結(jié)論:1高果糖培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞可引起ERS;兩種ERS抑制劑4-PBA和TUDCA均可以降低高果糖所致Hep G2細(xì)胞內(nèi)TG水平的升高,減輕Hep G2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積,抑制高果糖誘導(dǎo)的SREBP-1c、Ch REBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表達(dá)水平的增加,因此提示ERS與脂質(zhì)從頭合成密切相關(guān);2應(yīng)用兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicmycin和Thapsigargin引起ERS,使肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積增多,顯著增加肝臟脂質(zhì)合成酶的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c、Ch REBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表達(dá)水平,因此提示ERS可能參與脂質(zhì)從頭合成增多所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。第三部分IRE-1/XBP-1信號(hào)通路對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響目的:探討敲低XBP-1或過(guò)表達(dá)XBP-1s對(duì)Hep G2細(xì)胞的TG,脂質(zhì)沉積和SREBP-1c、Ch REBP、ACC、FAS、SCD-1的影響。方法:首先轉(zhuǎn)染針對(duì)Hep G細(xì)胞XBP-1的shRNA,分為四組:正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱N組)、高果糖組(簡(jiǎn)稱F組)、高果糖+陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱F+NC組)、高果糖+XBP-1 sh RNA組(簡(jiǎn)稱F+XBP-1 sh RNA組),再分別轉(zhuǎn)染針對(duì)Hep G細(xì)胞XBP-1s和XBP-1u的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,分為四組:未轉(zhuǎn)染組(簡(jiǎn)稱Untransfection組)、陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱pc DNA3.1(+)組)、XBP-1u上調(diào)組[簡(jiǎn)稱pc DNA3.1(+)-XBP-1u組]、XBP-1s上調(diào)組[簡(jiǎn)稱pc DNA3.1(+)-XBP-1s上調(diào)組],測(cè)定各組Hep G2細(xì)胞內(nèi)TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積,檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,以及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類(lèi)ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染XBP-1 sh RNA對(duì)XBP-1s的影響:F+XBP-1 sh RNA組的XBP-1s的表達(dá)水平比F組都顯著降低大于70%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說(shuō)明XBP-1s表達(dá)水平被有效抑制;2轉(zhuǎn)染XBP-1 sh RNA對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:F+XBP-1 sh RNA組TG比F組降低了34%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),油紅O染色示脂滴減少,F+NC組TG無(wú)變化(P0.05),油紅O染色示大量紅染,與F組無(wú)明顯差異;3轉(zhuǎn)染XBP-1sh RNA對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:F+XBP-1 sh RNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了40%(P0.01),Ch REBP無(wú)明顯變化(P0.05),ACC的蛋白表達(dá)水平降低(P0.01),FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)水平降低(均P0.05);4轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)IRE-1/XBP-1的影響:pc DNA3.1(+)-XBP1s組的活性XBP-1s表達(dá)水平比untransfection組、pc DNA3.1(+)組、pc DNA3.1(+)-XBP-1u組顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),XBP-1u和p-IRE-1/IRE-1水平比pc DNA3.1(+)-XBP-1u組明顯降低(P0.05),提示活性的XBP-1s被有效過(guò)表達(dá),XBP-1s與XBP-1u、IRE-1符合負(fù)反饋調(diào)控;5轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:pc DNA3.1(+)-XBP1s組TG升高50%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P0.01),油紅O染色示脂滴增多;6轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:pc DNA3.1(+)-XBP1s組SREBP-1c的基因水平的表達(dá)增加(P0.01),ACC、SCD-1的蛋白表達(dá)增加(均P0.01),FAS的蛋白表達(dá)增加(P0.05),Ch REBP無(wú)明顯變化。結(jié)論:1轉(zhuǎn)染針對(duì)Hep G2細(xì)胞XBP-1的sh RNA后,高果糖所誘導(dǎo)的甘油三脂沉積可以被緩解,同時(shí),SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平有所下降,提示IRE-1/XBP-1通路與脂質(zhì)從頭合成有關(guān);2上調(diào)Hep G2細(xì)胞XBP-1s后,可以引起甘油三脂沉積,SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1表達(dá)水平增加,提示SREBP-1c可能是IRE-1/XBP-1通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的重要靶點(diǎn),而Ch REBP可能并未參與該過(guò)程。第四部分PERK/e IF-2α/ATF-4信號(hào)通路對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響究目的:探討敲低或過(guò)表達(dá)ATF-4對(duì)Hep G2細(xì)胞的TG,脂質(zhì)沉積和SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1的影響。方法:首先轉(zhuǎn)染針對(duì)Hep G細(xì)胞ATF-4的siRNA,分為四組:正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱N組)、高果糖組(簡(jiǎn)稱F組)、高果糖+陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱F+NC組)、高果糖+ATF-4 si RNA組(簡(jiǎn)稱F+ATF-4 si RNA組),之后轉(zhuǎn)染針對(duì)Hep G細(xì)胞ATF-4 si RNA的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,分為四組:未轉(zhuǎn)染組(簡(jiǎn)稱Untransfection組)、陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱NC組)、ATF-4上調(diào)組(簡(jiǎn)稱ATF-4+組),測(cè)定各組Hep G2細(xì)胞內(nèi)TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積,檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類(lèi)ACC、FAS、SCD-1以及CHOP。結(jié)果:1轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)ATF-4和CHOP的影響:F+ATF-4 si RNA組ATF-4的表達(dá)水平比F組顯著降低大于70%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說(shuō)明ATF-4表達(dá)水平被有效抑制;轉(zhuǎn)染ATF-4 si RNA對(duì)CHOP的影響:F+ATF-4 si RNA組CHOP的表達(dá)水平比F組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);2轉(zhuǎn)染ATF-4 si RNA對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:F+ATF-4 si RNA組TG比F組降低了25%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),油紅O染色示脂滴減少,F+NC組TG無(wú)變化(P0.05),油紅O染色示大量紅染,與F組無(wú)明顯差異;3轉(zhuǎn)染ATF-4 si RNA對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:ATF-4 si RNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了28%(P0.01),Ch REBP的基因水平降低了20%(P0.05),ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)水平降低(均P0.01);4轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)ATF-4和CHOP的影響:ATF-4+組ATF-4的表達(dá)水平比untransfection組、NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01),提示ATF-4被有效過(guò)表達(dá);CHOP的蛋白表達(dá)水平增加(P0.01);5轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:ATF-4+組TG升高40%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),油紅O染色示脂滴增多;6轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:ATF-4+組SREBP-1c和Ch REBP的基因水平的表達(dá)增加(均P0.01),ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)增加(均P0.05)。結(jié)論:1轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG2細(xì)胞ATF-4的干擾si RNA后,高果糖所誘導(dǎo)的甘油三脂沉積可以被緩解,同時(shí),SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平有所下降,提示PERK/e IF-2α/ATF-4通路與脂質(zhì)從頭合成有關(guān);2上調(diào)Hep G2細(xì)胞ATF-4后,可以引起甘油三脂沉積,SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1表達(dá)水平增加,SREBP-1c和Ch REBP可能共同參與PERK/e IF-2α/ATF-4通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪性肝病 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白反應(yīng) 脂質(zhì)從頭合成 果糖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.5
【目錄】：

• 中文摘要5-13
• 英文摘要13-22
• 英文縮寫(xiě)22-24
• 引言24-27
• 第一部分 果糖刺激Hep G2 細(xì)胞高甘油三酯模型建立27-59
• 前言27-28
• 材料與方法28-44
• 結(jié)果44-46
• 附圖46-51
• 附表51-52
• 討論52-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響研究59-81
• 前言59-61
• 材料與方法61-63
• 結(jié)果63-65
• 附圖65-74
• 討論74-77
• 小結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 第三部分 IRE-1/XBP-1 信號(hào)通路對(duì) Hep G2 細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響81-97
• 前言81-82
• 材料與方法82-84
• 結(jié)果84-85
• 附圖85-90
• 討論90-93
• 小結(jié)93-94
• 參考文獻(xiàn)94-97
• 第四部分 PERK/e IF-2α/ATF-4信號(hào)通路對(duì)Hep G2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響究97-114
• 前言97-98
• 材料與方法98-100
• 結(jié)果100-101
• 附圖101-107
• 討論107-110
• 小結(jié)110
• 參考文獻(xiàn)110-114
• 結(jié)論114-115
• 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細(xì)胞脂肪變性115-128
• 參考文獻(xiàn)121-128
• 致謝128-129
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷129-13

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4 高志強(qiáng);陸付耳;冷三華;謝美娟;徐麗君;王開(kāi)富;鄒欣;;小檗堿對(duì)高果糖飼養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠肝組織HNF-4α表達(dá)的影響[J];世界華人消化雜志;2008年15期

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2 趙永才;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)高果糖喂養(yǎng)大鼠胰島功能的影響及機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 任路平;高果糖、高脂飲食致小鼠脂肪肝機(jī)制的探討[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1128875