本文關鍵詞：pEGFP-NTCP穩(wěn)定轉染HEK293細胞系的建立及鑒定

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【摘要】：目的高效快速地建立穩(wěn)定高表達鈉離子-�；悄懰峁厕D運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293細胞系。方法構建可表達EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重組質粒,并利用Fu GENE 6轉染試劑將重組質粒轉染至HEK293細胞中。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況,挑選轉染細胞進行14 d G418篩選和單克隆培養(yǎng),以獲得穩(wěn)定轉染細胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技術檢測穩(wěn)定轉染細胞及正常細胞中NTCP mRNA和蛋白的表達情況,并進一步用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)考察穩(wěn)定轉染細胞的�；悄懰釘z取能力。結果使用本文優(yōu)化的方法,細胞轉染率可達90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和�；撬釘z取實驗結果顯示:相對于正常組,在熒光顯微鏡下呈綠色熒光的轉染細胞;其NTCP表達均顯陽性(P0.01);且穩(wěn)定轉染細胞的牛磺膽酸攝取能力明顯升高(P0.05)。結論高效快速地建立了穩(wěn)定高表達NTCP的HEK293細胞系,為膽酸衍生物攝取機制研究奠定了基礎。
【作者單位】： 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心;貴州醫(yī)科大學藥學院;國家苗藥工程技術研究中心;貴州省藥物制劑重點實驗室;
【關鍵詞】： NTCP EGFP 穩(wěn)定轉染 �；悄懰� HEK細胞 高效快速
【基金】：國家自然科學基金資助項目(No 81460523) 貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項基金(No 2013-45號) 貴州省社會發(fā)展攻關計劃項目(No 2013-3031號) 貴州省中藥現代化科技產業(yè)研究開發(fā)專項(No 2013-4001號) 貴州省科學技術基金(No黔科合J字[2014]2018號)
【分類號】：R575
【正文快照】： 膽汁酸在肝臟中合成并儲備在膽囊,在食物的刺激下被腸道吸收,至回腸末端被腸壁吸收后,經門靜脈重新進入肝臟,被肝細胞攝取后再次分泌,進行肝腸循環(huán)[1]。研究發(fā)現,在肝腸循環(huán)中肝細胞對膽汁酸的攝取具有靶向性。而多數治療肝病的藥存在肝細胞富集能力差,對非靶器官毒性較大等缺

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本文編號：1112011