本文關鍵詞：中國人群HLA-Ⅰ類分子參與HCV1b型免疫逃逸突變的機制研究

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【摘要】：目的 由于缺乏預防性疫苗且治療費用昂貴,慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范圍內重大的公共衛(wèi)生難題。目前丙型肝炎病毒(hepatitis C, HCV)感染慢性化機制尚不明確,有研究表明CD8+T細胞應答失敗可能為HCV感染慢性化的重要機制之一。在歐美人群中的研究發(fā)現HCV病毒序列在宿主免疫壓力下能夠發(fā)生選擇性逃逸突變,進而影響病毒特異性CTL應答。中國人群與歐美人群遺傳背景不同,HCV在不同遺傳背景人群中的逃逸突變可能不同。目前在中國乃至亞洲地區(qū)人群中尚無宿主遺傳背景對于HCV逃逸CTL應答的研究。由于中國HCV主要基因型為lb型,且研究發(fā)現HCVNS3區(qū)存在較多CD8+T細胞表位,因此本研究擬擴增湖北地區(qū)人群HCV1b型NS3區(qū)序列,分析湖北地區(qū)HCV lb型序列變異情況,序列進化以及演變的規(guī)律：對湖北地區(qū)慢性HCV1b型患者進行HLA-A以及B類分子基因分型檢測,分析湖北地區(qū)人群HLA-I類分子遺傳背景與中國其他地區(qū)人群的異同之處,并比較數據庫中中國人群以及德國人群HLA-A以及B類分子等位基因頻率的異同；分析中國慢性HCV1b型NS3區(qū)在HLA-I類分子免疫壓力下發(fā)生選擇性逃逸突變的情況,比較不同遺傳背景人群中HCV lb型NS3區(qū)選擇性逃逸突變的差異；驗證HCV在HLA-I類分子限制性表位內發(fā)生選擇性逃逸突變對于CTL應答的影響。旨在明確中國人群宿主免疫壓力下HCVlb型的選擇性逃逸突變情況,探尋中國人群中HCVlb型選擇性逃逸突變對HCV感染慢性化以及HCV特異性CTL應答的影響及其可能的機制。 方法 1.收集慢性HCVlb型感染患者全血,分離血清,抽提血清中HCV RNA,采用型別特異性引物擴增法進行HCV基因分型。對HCV1b基因型的HCV采用巢式PCR方法進行NS3區(qū)擴增并測序。使用生物信息學軟件將HCV lb型患者的HCV NS3區(qū)序列進行序列比對,分析HCV NS3區(qū)的序列變異情況,并與其他地區(qū)HCV1b型NS3區(qū)以及德國anti-D人群NS3區(qū)序列進行序列比對以及進化樹分析。 2.分離血細胞,進行基因組DNA抽提,采用型別特異性引物PCR方法檢測湖北地區(qū)HCV1b型患者相應的HLA-A及B類分子等位基因。分析本實驗中人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率,并比較德國人群與中國人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率。 3.使用生物信息學軟件分析中國人群HCV1b型NS3區(qū)HLA-I類分子限制性CD8+T細胞表位內的序列突變是否與相應的HLA-I類分子相關。比較中國人群的突變情況與德國人群突變情況。 4.使用合成多肽對表達相應的等位基因的慢性HCV患者的外周血淋巴細胞進行HCV特異性增殖以及再刺激后進行IFN-γ細胞內細胞因子染色,再使用流式細胞術檢測分泌IFN-γ的細胞占CD8+T細胞的比值,進一步驗證CD8+T細胞表位內的選擇性突變對T細胞識別的影響。 結果 1.本實驗共獲得1b型HCV NS3區(qū)全長序列89例。所得序列經進一步進化樹分析確認為1b型,且湖北地區(qū)序列與中國其他地區(qū)lb型序列親緣性近,與日本、東南亞地區(qū)及歐美地區(qū)的lb型親緣性遠；將本實驗擴增獲得的中國HCV1b型NS3區(qū)與德國感染同一來源HCV污染的免疫球蛋白人群(anti-D cohort) NS3區(qū)以及德國散發(fā)感染人群的HCVlb型NS3區(qū)進行進化樹分析,發(fā)現中國人群序列主要落于兩個進化叢內,德國人群中anti-D cohort NS3區(qū)落于三個進化叢內,其他散發(fā)感染的lb型序列未見明顯進化叢。在本實驗中89例序列的兩個進化之間,患者性別,年齡,病毒載量以及HLA-I類分子表達頻率無明顯差異,提示中國HCV1b型兩個進化叢的產生主要是可能由于不同的兩個原始感染源所致。 2. HLA-A及B類分子分型檢測結果顯示：本實驗中人群表達頻率較高的HLA-A類分子有HLA-A*11(25.77%)、HLA-A*02(28.83%)、HLA-A*24(16.56%). HLA-A*30(4.91%)和HLA-A*33(9.82%),表達頻率較高的HLA-B類分子有HLA-B*40(13.25％)、HLA-B*15(15.66％).HLA-B*13(13.86％).HLA-B*46(14.46%)以及HLA-B*58(9.64%)。湖北地區(qū)人群與數據庫中中國人群的HLA-A及B類分子基因頻率無明顯差異。將數據庫中德國人群HLA-A以及HLA-B類分子的表達頻率與中國人群平均值進行比較,發(fā)現德國人群與中國人群的HLA-I類分子表達頻率有明顯差異：在HLA-A類分子中,中國人群中表達頻率較高的HLA-A*11、HLA-A*24口HLA-A*33在德國人群中表達頻率較低,而在德國人群中表達頻率高的HLA-A*03以及HLA-A*01在中國人群中表達頻率較低。在HLA-B類分子中,中國人群中表達頻率較高的HLA-B*40、HLA-B*15、 HLA-B*13.HLA-B*51、HLA-B*58和HLA-B*46在德國人群中表達頻率較低,而在德國人群中表達頻率高的HLA-B*44、HLA-B*07、HLA-B*08以及HLA-B*35在中國人群中表達頻率較低。 3. HLA-A及HLA-B類分子限制性表位內選擇性逃逸突變分析結果顯示中國人群慢性HCV1b型感染患者體內存在HLA-A及B類分子免疫壓力下的選擇性逃逸突變。在九個CD8+T細胞表位內相應HLA-A及B類分子陽性患者的突變頻率顯著高于陰性患者,差異具有統(tǒng)計學意義。將本實驗中HCV1b型序列在HLA-A以及B類分子的免疫壓力下發(fā)生的逃逸突變與德國人群中的逃逸突變進行比較,發(fā)現兩組人群HCVlb型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變情況不同。 4.體外T細胞功能檢測實驗結果驗證了新的HLA-A*11表位NS31635-1644,證實了該表位內HLA-A*11壓力下的V16351選擇性逃逸突變能夠影響CTL應答,NS31635-1644表位肽第二位的T1636N以及T1636S突變可影響CD8+T細胞應答,而1636位其他突變類型則不影響CD8+T細胞應答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。 結論 本研究詳細探討了中國地區(qū)HCV lb型的NS3區(qū)序列變異情況,對中國地區(qū)HCVlb型序列的演變進行了分析,系統(tǒng)比較了中國不同地區(qū)以及中國人群與德國人群HLA-A、B類分子基因頻率之間的差異,進行了中國人群HCV lb型在宿主免疫壓力下逃逸突變的分析,以及體外T細胞功能檢測實驗。研究結果發(fā)現中國與德國人群的HLA-A、B類分子表達頻率存在明顯差異,同時進一步驗證了中國HCV lb型可能存在兩個主要感染源；發(fā)現中國人群中存在宿主免疫壓力下HCV lb型的逃逸突變,且中國及德國人群HCV1b型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同,提示在不同遺傳背景人群中HCV lb型在宿主免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同。我們還發(fā)現了HCV1b型新的HLA-A*11限制性表位,驗證了HLA-I類分子免疫壓力下HCV1b型病毒序列的逃逸突變能夠影響CD8+T細胞應答,且表位肽不同位點的突變或相同位點不同的氨基酸突變對CD8+T細胞應答的影響各不相同,提示只有特定的氨基酸突變才能夠影響CTL應答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。提示該位點突變在HLA-B*75陽性患者中可能有恢復至原型的趨勢,推測HLA-B*75對HCV1b中國一致序列感染的患者可能有保護作用。 本研究于國內外首次分析了中國乃至亞洲地區(qū)人群遺傳背景對于HCV lb型逃逸宿主免疫應答的影響,部分闡述了中國人群HLA-I類分子參與HCV lb型免疫逃逸的機制,為后續(xù)基于T細胞應答的HCV治療性以及預防性疫苗的研發(fā)提供一定理論基礎。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒(HCV) HLA-I類分子 逃逸突變 CTL應答
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 中英文~.寫名詞對照表6-7
• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 緒論15-25
• 實驗材料與方法25-42
• 實驗材料25-30
• 實驗方法30-42
• 結果42-73
• 討論73-82
• 總結與展望82-84
• 參考文獻84-101
• 攻讀學位期間發(fā)表論文目錄101-102
• 致謝102-103

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1 夏幼辰;中國人群HLA-Ⅰ類分子參與HCV1b型免疫逃逸突變的機制研究[D];華中科技大學;2015年

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本文編號：1111597