發(fā)布時(shí)間：2017-10-26 04:06

  本文關(guān)鍵詞：硫化氫參與新生期結(jié)腸炎誘發(fā)成年大鼠慢性?xún)?nèi)臟痛的脊髓機(jī)制初步研究

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【摘要】：研究背景腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome,IBS)臨床表現(xiàn)為腹部疼痛不適,是一種常見(jiàn)的胃腸道疾病。至今,IBS的發(fā)病機(jī)理還尚未明確。已有研究結(jié)果顯示硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)在內(nèi)臟痛覺(jué)過(guò)敏的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而,內(nèi)臟痛敏過(guò)程中H2S在脊髓中的作用還不清楚。本課題旨在探究H2S在新生期結(jié)腸炎癥(neonatal colonic inflammation,NCI)模型鼠脊髓中如何參與內(nèi)臟痛敏的形成。實(shí)驗(yàn)方法1.NCI模型的建立:挑選出生后10天Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,將2cm導(dǎo)管插入大鼠肛門(mén),并向其腸道內(nèi)注射0.2 ml的0.5%冰醋酸(AA)從而誘導(dǎo)成年大鼠慢性?xún)?nèi)臟痛過(guò)敏模型。2.腹部撤回反射評(píng)分(abdominal wall reconstruction,AWR score):待大鼠6周齡時(shí),通過(guò)結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention,CRD)的方法比較對(duì)照組(CON)、NCI大鼠及注射藥物后大鼠的痛行為。3.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot):提取6周大鼠的胸腰椎段與T13-L2背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)相連接的脊髓背角,對(duì)其進(jìn)行蛋白定量分析,檢測(cè)NCI模型大鼠脊髓背角內(nèi)源性H2S的合成酶胱硫醚β合成酶(cystathionineβ-synthetase,CBS)的表達(dá)。4.脊髓切片膜片鉗技術(shù):記錄CON、NCI以及給藥處理后的脊髓膠狀質(zhì)(substantia gelatinosa,SG)的突觸傳遞及其神經(jīng)元的興奮性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.新生大鼠腸道注射0.5%冰醋酸,成年后測(cè)量其對(duì)CRD的反應(yīng),結(jié)果顯示NCI模型大鼠的AWR評(píng)分顯著高于CON組,提示大鼠產(chǎn)生內(nèi)臟痛覺(jué)高敏。2.NCI大鼠脊髓背角SG區(qū)神經(jīng)元興奮性增加。表現(xiàn)在其發(fā)放動(dòng)作電位(action potential,AP)的頻率在40 pA、80 pA和120 pA電流刺激下顯著增加,動(dòng)作電位閾值(AP threshold)超極化和基強(qiáng)度(rheobase)顯著降低,而靜息膜電位(resting membranepotential)沒(méi)有變化。3.nci大鼠可增強(qiáng)sg自發(fā)的興奮性突觸傳遞。利用脊髓切片膜片鉗技術(shù)測(cè)定sg中自發(fā)興奮性突觸后電流(spontaneousexcitatorypost-synapticcurrents,sepscs)的變化,結(jié)果顯示nci大鼠sg中sepsc的頻率顯著升高,但幅度沒(méi)有明顯變化。4.用westernblot方法檢測(cè)6周大鼠t13-l2段脊髓背角cbs的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與con組相比nci可顯著上調(diào)cbs的表達(dá)。與行為結(jié)果相一致:nci大鼠6周時(shí),其awr評(píng)分高于con組,表現(xiàn)為大鼠內(nèi)臟痛覺(jué)高敏。cse表達(dá)則無(wú)明顯改變。5.給正常大鼠脊髓切片孵育nahs(2.5μm)可增強(qiáng)sepsc的頻率,其幅度沒(méi)有明顯變化。6.正常大鼠脊髓切片孵育ttx(1.0μm)后再灌流nahs(2.5μm)記錄微小興奮性突觸后電流(miniatureexcitatorypost-synapticcurrents,mepscs)。結(jié)果顯示孵育nahs后mepsc頻率顯著升高,幅度沒(méi)有明顯差異。提示nahs通過(guò)突觸前機(jī)制發(fā)揮作用。7.連續(xù)7天給予正常大鼠鞘內(nèi)注射nahs(2.5μm)后,可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生內(nèi)臟高敏。模擬nci大鼠脊髓背角cbs上調(diào)引起的內(nèi)臟痛敏。8.連續(xù)7天給予nci模型大鼠鞘內(nèi)注射aoaa(10μg/kg)后,可顯著降低nci大鼠的內(nèi)臟高敏反應(yīng),提示cbs-h2s參與nci大鼠的內(nèi)臟痛敏。9.連續(xù)7天給予nci模型大鼠鞘內(nèi)注射aoaa(10μg/kg)后,可減弱nci大鼠脊髓背角sg神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞,提示cbs-h2s可在脊髓背角水平發(fā)揮作用參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟痛。結(jié)論新生期結(jié)腸炎導(dǎo)致成年大鼠脊髓背角神經(jīng)元興奮性增加和突觸傳遞增強(qiáng),脊髓背角cbs表達(dá)的上調(diào)可能參與了突觸傳遞增強(qiáng)和成年nci大鼠的內(nèi)臟高敏;cbs-h2s信號(hào)系統(tǒng)可能主要通過(guò)突觸前機(jī)制增加脊髓背角sg中細(xì)胞的興奮性突觸傳遞及sg神經(jīng)元的興奮性。本研究揭示了脊髓背角中的cbs-h2s信號(hào)在nci成年大鼠內(nèi)臟痛敏形成中的作用,為治療ibs患者的慢性?xún)?nèi)臟痛提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：慢性?xún)?nèi)臟痛 新生期結(jié)腸炎癥 硫化氫 脊髓背角 興奮性突觸后電流
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R574
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 第一章 引言10-12
• 第二章 材料與方法12-21
• 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象12
• 2.2 主要試劑12-13
• 2.3 主要儀器設(shè)備13-14
• 2.4 主要溶液配制14-16
• 2.5 新生期結(jié)腸炎癥（neonatal colonic inflammation, NCI）大鼠模型的建立16
• 2.6 腸道動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的行為學(xué)測(cè)試16
• 2.7 脊髓冠狀切片的制備16-17
• 2.8 脊髓切片膜片鉗記錄17-18
• 2.9 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)18-20
• 2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理20-21
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-32
• 3.1 NCI大鼠AWR評(píng)分顯著升高21
• 3.2 NCI提高脊髓背角SG神經(jīng)元的興奮性21-23
• 3.3 NCI增強(qiáng)SG區(qū)自發(fā)興奮性突觸傳遞23-25
• 3.4 NCI大鼠脊髓背角CBS表達(dá)水平升高25
• 3.5 NaHS對(duì)正常大鼠SG區(qū)sEPSCs的影響25-27
• 3.6 NaHS作用的突觸前機(jī)制27-28
• 3.7 鞘內(nèi)注射N(xiāo)aHS可使正常大鼠產(chǎn)生內(nèi)臟痛覺(jué)高敏28-29
• 3.8 AOAA翻轉(zhuǎn)NCI引起的內(nèi)臟高敏29-30
• 3.9 AOAA翻轉(zhuǎn)NCI引起的興奮性突觸傳遞增加30-32
• 第四章 討論32-35
• 參考文獻(xiàn)35-41
• 綜述：H_2S在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用41-55
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文與會(huì)議摘要55-56
• 致謝56-58

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