本文關(guān)鍵詞：NLRP3炎性小體對小鼠結(jié)腸炎的作用機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),是慢性的消化道炎癥,有克羅恩病(Crohn’s Disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)兩個(gè)亞型。越來越多的證據(jù)表明IBD是遺傳性宿主的黏膜免疫系統(tǒng)對共生菌發(fā)生的失調(diào)的免疫反應(yīng)。NOD2/CARD15被發(fā)現(xiàn)與人類的克羅恩病相關(guān)。此后,便有大量的實(shí)驗(yàn)來研究炎性小體在炎癥性和自身免疫性疾病中的作用。NLRP3炎性小體是其中研究最多的,它有廣泛的激活劑。它的效應(yīng)是通過IL-1β和IL-18發(fā)揮的,在IBD的發(fā)生發(fā)展中都有很大作用。然而,仍然不確定機(jī)體對NLRP3炎性小體是如何調(diào)控的。有研究表明ROS可以激活NLRP3炎性小體的組裝和活性。因此,關(guān)于氧化應(yīng)激和NLRP3炎性小體的相互作用,以及他們與IBD的關(guān)系值得深入研究。目的通過使用氮乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)和二乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate,DDC)來改變IBD模型小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài),檢測小鼠結(jié)腸和血清中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白及其m RNA表達(dá)水平,評估小鼠疾病活動度和結(jié)腸組織學(xué)改變情況。探討氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)劑對NLRP3炎性小體的調(diào)節(jié)及NLRP3炎性小體在結(jié)腸炎中的作用。方法1.模型的建立:SPF級雄性C57BL/6小鼠,6-8周,給予3%葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium,DSS)自由飲用10天。然后換滅菌水飲用2天。2.實(shí)驗(yàn)動物分組:SPF級雄性C57BL6小鼠隨機(jī)分為4組,每組12只。對照組:給予滅菌水自由飲用10天。模型組:給予3%DSS自由飲用10天。NAC組:除給予3%DSS自由飲用外,于1、3、5、7、9天接受NAC(250mg/kg/d)灌胃治療。DDC+DSS組:除給予3%DSS自由飲用外,于1、3、5、7、9天接受DDC(250mg/kg/d)灌胃治療。第11、12天所有小鼠均換用滅菌水自由飲用。3.每天監(jiān)測小鼠糞便情況和體重,所有小鼠于12天后全部眼球采血處死。收集血清、結(jié)腸標(biāo)本。4.根據(jù)小鼠糞便情況和體重改變進(jìn)行疾病活動度(disease activity index,DAI)評分,用伊紅-蘇木素染色檢測小鼠結(jié)腸組織病理改變,行組織學(xué)(histochemistry index,HI)評分,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠血清中的IL-1β和IL-18的表達(dá),用免疫組化(immunohistochemistry,IHC)和western blot檢測NLRP3和Caspase-1的表達(dá)情況。用Q-PCR檢測NLRP3和IL-1βm RNA的表達(dá)情況。5.用Graph Pad 6.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)用Levene方差齊性檢驗(yàn),對DAI評分、HI評分、輝度分析及m RNA的相對表達(dá)量的比較采用單因素方差分析(ANOVA),對方差分析有意義者再采用LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較。對各組免疫組化的結(jié)果的比較采用卡方檢驗(yàn),對卡方檢驗(yàn)有意義者再采用Fisher確切概率法兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.疾病活動指數(shù)(DAI)評分與對照組比較,用DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠有腹瀉、便血和體重下降。NAC組癥狀較模型組輕,DDC組癥狀較模型組重。四組的DAI評分有差異(F=51.8,P0.05),模型組高于對照組(7.86±0.98 vs 1.49±0.30),NAC組低于模型組(5.82±1.15 vs 7.86±0.98),DDC組高于模型組(9.92±1.63 vs 7.86±0.98),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.組織學(xué)(HI)評分與對照組比較,模型組的結(jié)腸黏膜固有層有大量的淋巴細(xì)胞為主的白細(xì)胞浸潤,血管增生,隱窩破壞。NAC組的鏡下表現(xiàn)較模型組輕,DDC組較模型組重。四組的HI評分有差異(F=69.58,P0.05),模型組高于對照組(6.52±0.67vs 0.50±0.31),NAC組低于模型組(4.58±1.12 vs 6.52±0.67),DDC組高于模型組(8.14±1.15 vs 6.52±0.67),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.血清中的IL-1β和IL-18的表達(dá)(ELISA)四組血清的IL-1β的表達(dá)有差異(F=23.96,P0.05),模型組高于對照組(86.5±7.88 vs 70.20±7.04),NAC組低于模型組(74.66±3.43 vs 86.5±7.88),DDC組高于模型組(99.15±4.17 vs 86.5±7.88),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。四組血清的IL-18的表達(dá)有差異(F=71.98,P0.05),模型組高于對照組(118.60±2.70 vs 102.20±6.50),NAC組低于模型組(89.40±3.58 vs 118.60±2.70),DDC組高于模型組(128.40±4.56 vs 118.60±2.70),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.NLRP3在結(jié)腸的表達(dá)(免疫組化法)四組結(jié)腸的NLRP3的表達(dá)有差異(χ2=16.67,P0.05),模型組高于對照組(75.0%vs 16.7%),NAC組低于模型組(25.0%vs 75.0%),DDC組高于模型組(83.3%vs 75.0%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.Caspase-1在結(jié)腸的表達(dá)(免疫印跡法)四組結(jié)腸的Caspase-1的表達(dá)有差異(F=22.08,P0.05),模型組高于對照組(0.65±0.13 vs 0.33±0.13),NAC組低于模型組(0.36±0.12 vs 0.65±0.13),DDC組高于模型組(0.89±0.13 vs 0.36±0.12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.NLRP3和IL-1βm RNA在結(jié)腸的表達(dá)(Q-PCR)四組結(jié)腸的NLRP3m RNA的表達(dá)有差異(F=145,P0.05),模型組高于對照組(6.17±0.56vs1.35±0.44),NAC組低于模型組(3.11±0.34vs 6.17±0.56),DDC組高于模型組(7.63±0.71vs 6.17±0.56),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。四組結(jié)腸的IL-1βm RNA的表達(dá)有差異(F=22.53,P0.05),模型組高于對照組(1.34±0.27vs0.41±0.15),NAC組低于模型組(0.97±0.15vs 1.34±0.27),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.予6-8周的SPF級雄性C57BL/6小鼠飲用3%DSS可以成功誘導(dǎo)出結(jié)腸炎。2.NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18上調(diào)參與小鼠結(jié)腸炎的發(fā)病,氧化應(yīng)激抑制劑NAC可以抑制其上調(diào),緩和結(jié)腸炎癥,而氧化應(yīng)激激活劑DDC可以促進(jìn)其上調(diào),加重結(jié)腸炎癥。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸炎 氧化應(yīng)激 NLRP3 炎性小體
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略詞表12-13
• 引言13-16
• 材料與方法16-27
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-25
• 3 統(tǒng)計(jì)分析方法25-27
• 結(jié)果27-34
• 1 疾病活動指數(shù)(DAI)評分27
• 2 組織學(xué)(HI)評分27-29
• 3 血清中的IL-1β和IL-18 的表達(dá)(ELISA)29-30
• 4 NLRP3 在結(jié)腸的表達(dá)(免疫組化法)30-31
• 5 Caspase-1 在結(jié)腸的表達(dá)(免疫印跡法)31-32
• 6 NLRP3 和IL-1βm RNA在結(jié)腸的表達(dá)(Q-PCR)32-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述 NLRP3 炎性小體與炎癥性腸病的研究進(jìn)展43-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 個(gè)人簡歷及在校期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63

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本文編號：1096461