本文關(guān)鍵詞：間歇低氧對(duì)肝臟損傷機(jī)制及自噬在肝臟中作用機(jī)制的探討

  更多相關(guān)文章： 間歇低氧 炎癥因子 CYP 自噬 LO2細(xì)胞 核受體

【摘要】：目的:阻塞性睡眠呼吸暫停(Obstructive sleep apnea,OSA)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過(guò)10%的人群罹患此病。OSA對(duì)于身體的嚴(yán)重危害及致死率增加,主要是因?yàn)镺SA常合并糖尿病,代謝綜合征,心血管系統(tǒng)疾病等。目前很多證據(jù)顯示,由于OSA患者發(fā)生了氣體交換障礙(反復(fù)低血氧和高碳酸血癥)的病生理改變,即慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),導(dǎo)致前炎癥因子產(chǎn)物增多,血管內(nèi)皮功能紊亂,氧化應(yīng)激,代謝調(diào)節(jié)異常和胰島素抵抗等。因?yàn)楦闻K在人體是十分重要的代謝器官,肝細(xì)胞對(duì)各種內(nèi)源性和外源性刺激如病毒感染、炎癥、營(yíng)養(yǎng)等非常敏感,現(xiàn)有很多報(bào)道OSA與肝臟的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)有關(guān)。本研究旨在通過(guò)間歇低氧動(dòng)物模型探討間歇低氧引起的肝臟損害,對(duì)肝臟藥物代謝酶細(xì)胞色素酶P450(Cytochrome P450,CYPs)的影響及作用機(jī)制,從自噬角度對(duì)間歇低氧的作用做了進(jìn)一步探討。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞色素酶P450(Cyps)的表達(dá)有重要的調(diào)控作用,并且對(duì)自噬有一定影響,所以我們又通過(guò)人的正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞初步探討糖皮質(zhì)激素在人肝臟細(xì)胞CYPs代謝的影響及自噬中的作用。方法:1.建立間歇低氧(intermittent hypoxia,IH)大鼠模型,將30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組(按照每組15只分組):IH組和對(duì)照組。2.大鼠肝臟組織進(jìn)行固定、包埋、病理切片,然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。3.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定炎癥因子、Cyps、NF-κB、核受體的相對(duì)基因表達(dá)量。4.使用實(shí)時(shí)定量PCR法分析肝臟自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)。5.將人正常肝細(xì)胞LO2肝細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),然后傳代,將傳代細(xì)胞按順序分別接種于6孔板,根據(jù)加入藥物不同,分為對(duì)照組,糖皮質(zhì)激素(地塞米松,DEX)組和糖皮質(zhì)激素+糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(DEX+R)組;對(duì)照組:正常細(xì)胞培養(yǎng);DEX組:加入地塞米松進(jìn)行培養(yǎng);DEX+R組:在DEX組基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑。6.通過(guò)倒置顯微鏡觀察人肝細(xì)胞LO2細(xì)胞形態(tài)的改變及生長(zhǎng)情況變化并進(jìn)行拍照。7.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定肝細(xì)胞LO2細(xì)胞Cyps的相對(duì)基因表達(dá)量。8.使用實(shí)時(shí)定量PCR法分析測(cè)定肝細(xì)胞LO2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)。結(jié)果:1.對(duì)照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變:對(duì)照組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整,竇狀隙及匯管區(qū)未見明顯增寬及結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞胞膜完整,胞質(zhì)豐富,胞核形態(tài)正常,與正常肝組織無(wú)差異;間歇低氧組:肝小葉結(jié)構(gòu)完整,竇狀隙呈輕度增寬,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,匯管區(qū)可見少許炎細(xì)胞浸潤(rùn),以淋巴細(xì)胞為主,少許肝細(xì)胞胞質(zhì)稀疏。2.肝組織炎癥介質(zhì)m RNA相對(duì)表達(dá)量的改變:IH組IL-1β、IL-6、TNFαm RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高。3.肝組織NF-κB m RNA相對(duì)表達(dá)量的改變:IH組NF-κB m RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高。4.核受體m RNA相對(duì)表達(dá)量的改變:IH組PXR、GR、CAR m RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)。5.細(xì)胞色素氧化酶P450(Cyps)m RNA相對(duì)表達(dá)量的改變:IH組Cyp1A2、Cyp2D4、Cyp3A2 m RNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Cyp2C9、Cyp2C19 m RNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。6.細(xì)胞自噬相關(guān)基因(Atg)相對(duì)表達(dá)量的改變:IH組與對(duì)照組相比,AMPK,m TOR,Beclin1,Atg5,Atg12,Atg13,ULK1均有相應(yīng)改變但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LC3與WIPI的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.肝LO2細(xì)胞生長(zhǎng)情況:地塞米松組LO2細(xì)胞生長(zhǎng)變形,呈梭形生長(zhǎng),而加入糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑組,LO2細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組相同,為正常細(xì)胞形態(tài)。8.肝LO2細(xì)胞Cyps表達(dá):通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR詳細(xì)闡述了各組人細(xì)胞色素酶P450(h CYP450)中h CYP1A2、h CYP2C9、h CYP2C19、h CYP2D6、h CYP3A4m RNA在人肝臟LO2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比,Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的h CYP1A2、h CYP2C19、h CYP3A4 m RNA表達(dá)量上調(diào),相應(yīng)的,Dex+R組人肝臟LO2細(xì)胞的上述基因表達(dá)下調(diào),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);而Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的h CYP2C9基因表達(dá)量較對(duì)照組為下降趨勢(shì),h CYP2D6基因表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)顯著變化9.肝LO2細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá):通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR詳細(xì)闡述了各組細(xì)胞的自噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,除Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的Beclin1 m RNA表達(dá)量下調(diào)(p0.05)外,余細(xì)胞自噬相關(guān)的基因及參與自噬過(guò)程的自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量較對(duì)照組均無(wú)顯著變化。結(jié)論:1.間歇低氧可以引起肝臟結(jié)構(gòu)改變,促進(jìn)炎性因子釋放,并通過(guò)NF-κB-核受體通路來(lái)影響細(xì)胞色素酶Cyps的表達(dá);2.間歇低氧可以通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體通路誘導(dǎo)肝臟自噬,保護(hù)肝臟避免凋亡發(fā)生;3.糖皮質(zhì)激素可以影響肝細(xì)胞生長(zhǎng),并使細(xì)胞色素Cyps表達(dá)受影響;但是從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看,對(duì)肝細(xì)胞自噬發(fā)生沒有誘導(dǎo)作用。
【關(guān)鍵詞】：間歇低氧 炎癥因子 CYP 自噬 LO2細(xì)胞 核受體
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R766;R575
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-13
• 前言13-18
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 技術(shù)路線16-18
• 一、間歇低氧對(duì)大鼠肝臟損害及藥物代謝酶影響18-39
• 1.1 材料和方法18-25
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料18-21
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法21-25
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)分析25
• 1.2 結(jié)果25-29
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)觀察25-26
• 1.2.2 肝組織炎癥介質(zhì)mRNA定量PCR結(jié)果26-27
• 1.2.3 肝組織Cyp450 mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果27-28
• 1.2.4 肝組織中NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果28
• 1.2.5 肝組織中核受體mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果28-29
• 1.3 討論29-38
• 1.3.1 阻塞性睡眠呼吸暫停與器官損害：29-32
• 1.3.2 間歇低氧引起肝臟的損害：32-34
• 1.3.3 NF-κB-核受體通路在肝臟中的作用34-38
• 1.4 小結(jié)38-39
• 二、間歇低氧對(duì)大鼠肝臟自噬的影響39-56
• 2.1 材料和方法39-42
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物39
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組39-40
• 2.1.3 間歇低氧大鼠模型建立40
• 2.1.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR40-42
• 2.1.5 統(tǒng)計(jì)分析42
• 2.2 結(jié)果42-43
• 2.3 討論43-55
• 2.3.1 自噬的發(fā)生及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)43-49
• 2.3.2 自噬相關(guān)蛋白在自噬中的作用49-52
• 2.3.3 間歇低氧與細(xì)胞自噬52-55
• 2.4 小結(jié)55-56
• 三、糖皮質(zhì)激素在肝細(xì)胞自噬中的作用56-73
• 3.1 材料和方法56-63
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料56-57
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材57-58
• 3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理58-59
• 3.1.5 人肝臟LO2細(xì)胞總RNA提取及Qrt-PCR59-62
• 3.1.6 統(tǒng)計(jì)分析62-63
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-65
• 3.2.1 肝正常細(xì)胞LO2細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況63-64
• 3.2.2 人肝臟LO2細(xì)胞細(xì)胞色素氧化酶P450的表達(dá)64
• 3.2.3 人肝臟LO2細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果64-65
• 3.3 討論65-73
• 3.3.1 自噬在肝臟中的作用65-67
• 3.3.2 自噬介導(dǎo)的肝臟代謝67-70
• 3.3.3 糖皮質(zhì)激素在自噬中的作用70-73
• 全文結(jié)論73-74
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-84
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明84-85
• 附錄85-86
• 綜述86-106
• 綜述參考文獻(xiàn)95-106
• 致謝106-108
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷108

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本文編號(hào)：1090186