本文關(guān)鍵詞：c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布作用于肝膽管結(jié)石并膽管癌的實驗研究

  更多相關(guān)文章： 肝膽管結(jié)石 膽管癌 c-Met COX-2 凋亡

【摘要】：背景肝膽管結(jié)石常指發(fā)生于左、右肝膽管及其分支內(nèi)的結(jié)石,常合并肝外膽管結(jié)石、肝內(nèi)外膽管狹窄和肝臟的纖維化改變。文獻中關(guān)于肝膽管結(jié)石的記載始于16世紀(jì)左右。肝膽管結(jié)石多見于亞洲,中國大陸此病發(fā)病率較高。肝內(nèi)膽管結(jié)石合并感染反復(fù)發(fā)作是導(dǎo)致肝內(nèi)膽管癌發(fā)生的常見因素。肝內(nèi)膽管癌(ICC)是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤疾病,發(fā)病年齡多為50-70歲。膽管癌的病因目前尚不清楚,有研究表明,常年患有肝膽管結(jié)石的病例是膽管癌的高發(fā)人群,肝膽管結(jié)石患者2%-10%的病例有發(fā)生膽管癌的風(fēng)險,一般認為是肝膽管結(jié)石對膽管壁的長期機械刺激及其所引起的慢性膽道感染和膽汁淤積等因素可導(dǎo)致膽管壁的慢性增生性炎癥、受累區(qū)域的肝膽管擴張、膽管呈環(huán)狀或節(jié)段性狹窄；受累膽管壁可增厚、膽管壁及周圍纖維組織增生并慢性炎癥細胞浸潤；匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤和纖維細胞增生,伴有肝實質(zhì)損害,嚴重者形成肝段或肝葉的纖維化萎縮和肝功能損害。而膽管壁炎性增厚,纖維化和狹窄,繼而引起膽管黏膜上皮的不典型增生。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),膽管黏膜上皮的不典型增生可逐漸移行成腺癌。然而,當(dāng)出現(xiàn)肝膽管結(jié)石合并膽管癌時,由于在臨床表現(xiàn)上患者多與單純性肝膽管結(jié)石并發(fā)膽管炎相類似,而無特異性,同時在臨床檢查時往往由于結(jié)石與腫瘤的并存,容易掩蓋腫瘤的存在造成漏診而錯過了最佳治療時機,因此,積極開展對肝膽管結(jié)石并膽管癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究有重要的現(xiàn)實意義。很多基礎(chǔ)、臨床和流行病學(xué)的研究已經(jīng)證實,炎癥是一個明確可以導(dǎo)致腫瘤的危險因素。炎癥與腫瘤的關(guān)系最早引起研究者的關(guān)注,是因為人們在腫瘤的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了免疫細胞浸潤。當(dāng)時這個現(xiàn)象大多被解釋成為機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的應(yīng)答,但是后來有研究認為“腫瘤起源于慢性炎癥”。此外,在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的免疫細胞類型與非腫瘤性炎癥部位的細胞類型一致。此后越來越多的科學(xué)家深入研究腫瘤與炎癥的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)慢性炎癥是許多惡性腫瘤發(fā)生的高危因素,參與惡變、腫瘤形成、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個過程,被列為腫瘤細胞十大生物學(xué)特征之一。炎癥,特別是慢性炎癥,是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進展的重要因素之一,而這類疾病有學(xué)者稱之為是“炎癥相關(guān)性腫瘤”。導(dǎo)致各種炎癥相關(guān)性腫瘤的病原明顯是不相關(guān)的,然而它們之間在病理特征上關(guān)鍵的共同特點是可以持續(xù)介導(dǎo)炎癥：最初是由激活的巨噬細胞、淋巴細胞的浸潤,然后是被由纖維細胞和血管生成相關(guān)細胞組成的間質(zhì)激活。同時認為這些浸潤的炎癥細胞持續(xù)產(chǎn)生的ROS和NO可能會損傷正常細胞。這可能會反過來導(dǎo)致代償性的細胞增殖,之后導(dǎo)致DNA損傷、基因突變的積累,并有效地把內(nèi)源性及外源性腫瘤因子帶入正常生長的細胞當(dāng)中。除此之外,近期也發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境可以加速表觀遺傳學(xué)的改變,這些改變可能導(dǎo)致炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生。c-Met是一種由c-Met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,為肝細胞生長因子(HGF)的受體,具有酪氨酸激酶活性,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細胞信息傳導(dǎo)、細胞骨架重排的調(diào)控,是細胞增殖、分化和運動的重要因素。肝細胞生長因子(HGF)是c-Met受體的配體,主要由間充質(zhì)細胞產(chǎn)生,以自分泌和旁分泌的方式起效,屬于典型的間質(zhì)細胞來源的生長因子；HGF能刺激多種細胞生長,并參與血管生成及免疫活性的調(diào)節(jié),還可促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,是一種具有多種功能的生物因子。當(dāng)c-Met與其配體HGF結(jié)合后,胞質(zhì)中酪氨酸殘基(Tyr1234、Tyr1235)可發(fā)生自身磷酸化,從而激活c-Met胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中酪氨酸激酶,激活的PTK可引起c-Met羧基末端酪氨酸的自身磷酸化。隨后,細胞質(zhì)中的多種效應(yīng)蛋白募集到磷酸化的羧基末端并被快速磷酸化,最后激活細胞內(nèi)多種信號通路。研究發(fā)現(xiàn),c-Met通路異常會誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移；c-Met與腫瘤對多種激酶抑制劑的耐藥性相關(guān)；c-Met可與多種膜受體之間的相互作用促進了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性。在腫瘤細胞中有許多分子機制可以激活c-Met,最常見的方式是通過HGF和c-Met結(jié)合發(fā)揮作用。HGF和c-Met結(jié)合導(dǎo)致受體自身磷酸化,增強了c-Met酪氨酸激酶的活性,導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化。以c-Met為作用靶點的藥物酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)逐步進入了臨床試驗階段,而PF-2341066是在2011年獲得美國FDA受理進入優(yōu)先評審程序的一種c-Met抑制劑。人類COX-2基因定位于1號染色體的1q25.2-q25.3,全長8.3 kb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子構(gòu)成,編碼604個氨基酸殘基組成的多肽。COX-2與COX-1具有61%的同源性,但卻表現(xiàn)出明顯的功能差異。COX-2主要分布于細胞核膜上,其表達調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平。誘導(dǎo)其表達的因素包括癌基因、白細胞介素-1、缺氧、紫外線、轉(zhuǎn)化生長因子和腫瘤壞死因子-α等,而地塞米松、抗氧化劑、抑癌蛋白P53則可抑制其表達。COX-2的致癌機制,現(xiàn)在比較認同的觀點是認為COX-2可通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進血管形成、抑制免疫功能等機制,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。其中主要是促進細胞增殖和抑制凋亡、促進血管形成。塞來昔布(Celecoxib)是第一個上市的COX-2選擇性抑制劑。美國佛雷德里克的國家癌癥研究所的Xu等研究人員發(fā)現(xiàn)COX-2的抑制劑塞來昔布具有抗血管生成的效用。美國Emory大學(xué)研究者的一項研究顯示,塞來昔布可能通過激活外源性死亡受體通路引起非小細胞肺癌腫瘤細胞的凋亡。研究人員利用小鼠模型,通過塞來昔布抑制COX-2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),VEGF通路的抑制被明顯增強了,最終得以有效抑制腫瘤生成及轉(zhuǎn)移、延長了生存期。隨著對腫瘤生物行為的不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)血管生成對腫瘤的生長、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。腫瘤血管生成由正負兩方面調(diào)節(jié),其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的促血管生長因素。腫瘤發(fā)展的過程可分為無血管和有血管兩個階段,對于無血管階段,腫瘤細胞主要依靠彌散活動,由鄰近的血供系統(tǒng)獲得氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),并運走代謝產(chǎn)物,此時腫瘤細胞的凋亡率很高,體積很少超過1～2mm3,腫瘤呈休眠狀態(tài),這一過程可持續(xù)數(shù)周或數(shù)年。而一旦腫瘤細胞發(fā)生具有抗凋亡活性表型的突變,即轉(zhuǎn)入有血管階段。進入有血管階段后,瘤體快速增大并可能發(fā)生轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞,參與腫瘤血管的新生,為血管內(nèi)皮細胞的遷移及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)。當(dāng)腫瘤組織直徑1cm以后,被激活的腫瘤組織通過自分泌或旁分泌機制合成和分泌VEGF,促進腫瘤周圍組織建立起豐富的毛細血管網(wǎng),在VEGF等血管生成因子的作用下,血管內(nèi)皮細胞分泌膠原酶和纖溶酶原借以降解血管基底膜,同時,腫瘤組織內(nèi)部新形成的微血管基膜不完善,這使得腫瘤細胞并不需要很復(fù)雜的侵襲過程就能直接進入到血道中,有利于腫瘤細胞在新的部位生長及增殖。有研究表明,c-Met可作用于COX-2。Jones等對大鼠胃上皮細胞的研究認為,HGF通過c-Met磷酸化和ERK-2細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來激活COX-2基因的表達。c-Met基因表達陽性的胃癌組織中微血管密度均值顯著高于陰性組,說明c-Met基因表達陽性的胃癌細胞更易生成腫瘤微血管,可能機制是上調(diào)COX-2表達和增加前列腺素合成,從而影響胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。目的探討COX-2和C-Met在肝膽管結(jié)石合并膽管癌組織中,二者的組織表達情況；觀察PF-2341066及塞來昔布聯(lián)合作用于膽管癌細胞株QBC939及膽管癌裸鼠荷瘤模型的實驗效果；探討HGF—c-Met—COX-2—PGE2—VEGF是否為促進膽管癌血管生成的一個潛在信號通路：探討c-Met抑制劑PF-2341066及COX-2抑制劑塞來昔布的聯(lián)合使用能否為該類腫瘤未來的治療策略提供一種新的靶點治療方案。方法1.Western blot法、RT-PCR檢測膽管癌組織中c-Met、COX-2的表達,分析其與該疾病臨床病理征之間的關(guān)系。2. c-Met和COX-2的表達水平與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后關(guān)系的分析方法：c-Met和COX-2的表達水平與肝膽管結(jié)石并膽管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis法檢驗分析；二者與患者預(yù)后關(guān)系采用Cox比例風(fēng)險回歸分析模型(Cox proportional hazards model)進行分析。3.MTT法檢測細胞生長：體外培養(yǎng)膽管癌QBC939細胞株,然后用c-Met抑制劑PF-2341066聯(lián)合塞來昔布進行干預(yù),檢測細胞增殖情況。4.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：體外培養(yǎng)膽管癌QBC939細胞株,然后用c-Met抑制劑PF-2341066聯(lián)合塞來昔布進行干預(yù),采用Annexin V-EGFP和Propidium Iodide染色,染色后采用流式細胞儀進行分析,檢測細胞凋亡情況。5.構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,采用PF-2341066聯(lián)合塞來昔布對其進行干預(yù),MTT法和流式細胞術(shù)分別檢測腫瘤細胞增殖和凋亡情況。結(jié)果1. c-Met、COX-2在肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中的蛋白表達均為最高,其在癌旁組織中的表達又比在肝膽管結(jié)石膽管組織及正常組織中高,組間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.肝膽管結(jié)石并膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2表達水平明顯與膽管癌的腫瘤分期有關(guān),腫瘤分期為Ⅲ和Ⅳ期的膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2表達明顯高于分期為Ⅰ和Ⅱ期的膽管癌組織(P0.05); c-Met和COX-2表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有顯著的相關(guān)性,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的膽管癌組織內(nèi)c-Met和COX-2水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的膽管癌組織(P0.05)；此外已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶患者的膽管癌組織中c-Met和COX-2表達水平也明顯高于沒有遠處轉(zhuǎn)移灶的膽管癌組織(P0.05)；由此可見,c-Met和COX-2在膽管癌的臨床進展和遠處轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮了重要作用。3.采用Cox多因素回歸分析膽管癌患者的預(yù)后相關(guān)因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn),癌組織中c-Met和COX-2表達高的患者預(yù)后更差,提示c-Met、COX-2的表達與患者預(yù)后呈負相關(guān),c-Met與COX-2可能是膽管癌預(yù)后的危險因素(P0.05)。此外統(tǒng)計分析提示,腫瘤的分期(P0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P0.05)和遠處是否存在轉(zhuǎn)移灶(P0.05)同樣是膽管癌患者預(yù)后的危險因素。4.使用膽管癌細胞株QBC939進行體外實驗,采用不同濃度的c-Met抑制劑作用QBC939細胞后,檢測其增殖與凋亡的變化,結(jié)果顯示QBC939細胞的增殖抑制率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高,并且發(fā)現(xiàn)在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組中的細胞增殖抑制率最高,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。同樣方法處理細胞后,使用流式細胞儀對QBC939細胞的凋亡進行檢測,結(jié)果顯示,QBC939的細胞凋亡率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高,并且發(fā)現(xiàn)在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組中的細胞凋亡率最高,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)5.采用不同濃度的c-Met抑制劑作用QBC939細胞株后,對細胞的c-Met、 COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達水平進行檢測,可以發(fā)現(xiàn)c-Met、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達水平隨c-Met抑制劑的濃度增加而降低,并在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組中的表達最低,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。6.構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,采用c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布干預(yù)荷瘤裸鼠后,對腫瘤體積大小進行比較,發(fā)現(xiàn)腫瘤體積隨c-Met抑制劑濃度增加而減小PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的腫瘤平均體積最小,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)7.采用不同濃度的c-Met抑制劑對荷瘤裸鼠進行干預(yù)作用后,檢測其腫瘤細胞增殖與凋亡的變化。結(jié)果顯示,腫瘤細胞的增殖抑制率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高,并且在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的增殖抑制率最高,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。同樣方法處理細胞后,使用流式細胞儀對細胞凋亡進行檢測,結(jié)果顯示,細胞凋亡率隨c-Met抑制劑濃度增高而增高,并且在聯(lián)合用藥組的凋亡率最高,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。8.采用不同濃度的c-Met抑制劑對荷瘤裸鼠進行干預(yù)作用后,對腫瘤組織的c-Me、COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達水平進行檢測,可以發(fā)現(xiàn)c-Met、 COX-2、VEGF蛋白與mRNA表達水平隨c-Met抑制劑濃度的增加而降低,并在PF-2341066和塞來昔布聯(lián)合用藥組的表達最低,與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中c-Met及COX-2的表達較癌旁組織、正常膽管組織明顯升高,提示二者在肝膽管結(jié)石并膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要的作用。2肝膽管結(jié)石并膽管癌組織中c-Met及COX-2的表達水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移灶有明顯的相關(guān)性,因此推測二者可能與肝膽管結(jié)石并膽管癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。3使用c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布能夠降低荷瘤裸鼠腫瘤體積,促進細胞凋亡,推測c-Met及COX-2可能是影響膽管癌腫瘤進展的重要因素。4 c-Met及COX-2的抑制劑可能是肝膽管結(jié)石并膽管癌未來潛在的靶點藥物,有望為肝膽管結(jié)石并膽管癌的輔助治療帶來新的前景。5 c-Met抑制劑PF-2341066和COX-2抑制劑塞來昔布對膽管癌細胞的生長有協(xié)同抑制效應(yīng),但c-Met與COX-2之間是否存在促進膽管癌血管生成的交叉信號通路還有待更深入的研究。
【關(guān)鍵詞】：肝膽管結(jié)石 膽管癌 c-Met COX-2 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.8;R575.7
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 前言22-28
• 第一部分 c-Met與COX-2在肝膽管結(jié)石合并膽管癌組織、癌旁膽管組織、肝膽管結(jié)石以及正常膽管組織中的表達及其預(yù)后相關(guān)性的研究28-48
• 引言28-29
• 材料與方法29-35
• 結(jié)果35-44
• 討論44-48
• 第二部分 c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布對膽管癌細胞株QBC939的體外作用觀察研究48-82
• 引言48
• 材料與方法48-55
• 結(jié)果55-74
• 討論74-82
• 第三部分 c-Met抑制劑聯(lián)合塞來昔布作用于裸鼠模型的實驗效果觀察82-101
• 引言82
• 材料與方法82-84
• 結(jié)果84-97
• 討論97-101
• 結(jié)論101-102
• 參考文獻102-123
• 綜述123-133
• 參考文獻126-133
• 攻讀學(xué)位期間成果133-134
• 致謝134-136
• 中英文縮略詞136-137

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李康英,謝光輝,黃霈,王存川,楊見權(quán);經(jīng)膽道鏡激光碎石治療肝膽管結(jié)石[J];中國激光醫(yī)學(xué)雜志;2000年03期

2 黃長玉,黃建富,殷鳳峙,沈娟,陳燕凌,蔡欣然;肝膽管結(jié)石合并肝膽管癌臨床特征的探討[J];肝膽外科雜志;2001年02期

3 李榮 ,高焱明 ,梅方雄;硬質(zhì)膽鏡與纖維膽鏡治療肝膽管結(jié)石比較[J];中國內(nèi)鏡雜志;2002年01期

4 吳金術(shù),易為民,蔣波,劉冀寧,劉初平,毛先海,周力學(xué);肝膽管結(jié)石合并肝肥大—萎縮征的診治(附262例報告)[J];肝膽外科雜志;2003年01期

5 王偉林,蔣智軍,鄭樹森;肝膽管結(jié)石合并肝膽管癌的診治[J];中華普通外科雜志;2005年05期

6 祝學(xué)光;肝膽管結(jié)石成因研究近況[J];臨床外科雜志;2005年07期

7 梁力建,鄧偉;肝膽管結(jié)石和肝膽管癌[J];臨床外科雜志;2005年07期

8 陶修翠;李儒文;趙霞;趙輝;王昌華;;神農(nóng)化石丹Ⅱ號治療術(shù)后再發(fā)肝膽管結(jié)石86例[J];中醫(yī)雜志;2007年02期

9 陶修翠;李儒文;趙霞;趙輝;王昌華;;神農(nóng)化石丹Ⅱ號治療術(shù)后再發(fā)肝膽管結(jié)石86例觀察[J];實用中醫(yī)藥雜志;2007年03期

10 黃建富;;肝膽管結(jié)石并肝膽管癌診治[J];肝膽外科雜志;2007年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王偉林;蔣智軍;鄭樹森;;肝膽管結(jié)石合并肝膽管癌的診治[A];2004年浙江省外科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2004年

2 王益鐘;馮文明;;中西醫(yī)結(jié)合治療肝膽管結(jié)石的可行性探討[A];浙江省第二十屆基層衛(wèi)生改革與發(fā)展學(xué)術(shù)會議大會論文集[C];2012年

3 譚華;;對肝膽管結(jié)石發(fā)病原因再認識[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第十二次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2000年

4 馬俊杰;王全剛;郭波;;中西藥結(jié)合治療肝膽管結(jié)石臨床應(yīng)用(附36例臨床報告)[A];第八屆全國中西醫(yī)結(jié)合普通外科臨床與基礎(chǔ)學(xué)術(shù)會議暨全國中西醫(yī)結(jié)合外科危重病學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2003年

5 劉杰;;肝膽管結(jié)石的綜合療法[A];第七屆全國中西醫(yī)結(jié)合普通外科臨床及基礎(chǔ)研究學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

6 畢德明;楊余朋;劉勇;馮乃兵;;肝膽管結(jié)石合并膽汁性肝硬化的外科處理[A];2008年中醫(yī)外科學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

7 魏琪;蔡秀軍;忻瑩;周偉;牟一平;;手助腹腔鏡肝段切除治療肝膽管結(jié)石[A];2006年浙江省微創(chuàng)外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

8 張z，

本文編號：1090352