發(fā)布時間：2017-10-18 07:48

  本文關(guān)鍵詞：組蛋白修飾參與化學(xué)致癌劑MNNG和MNU誘發(fā)人胃粘膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制研究

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【摘要】：單功能烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)和N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)是實驗室普遍使用的模式化學(xué)誘變劑,用于研究環(huán)境中廣泛存在的N-亞硝基化合物(NOC)的致癌機制。我們實驗室利用低劑量的MNNG和MNU多次、反復(fù)處理人胃粘膜上皮細胞GES-1,建立了化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的細胞惡性轉(zhuǎn)化模型。為研究表觀遺傳修飾參與細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制,我們對組蛋白H3和H4的主要修飾位點進行了差異分析。結(jié)果顯示惡性轉(zhuǎn)化細胞中以H3S10p和H3S28p為代表的H3磷酸化水平發(fā)生明顯上調(diào),而以H4K16ac為代表的H4乙�；絽s顯著降低。我們的進一步研究表明,引起H3S10p上調(diào)的主要上游激酶是MSK1,其激活僅部分依賴于ERK/MAPK信號通路,更主要的調(diào)控機制可能來源于其表達水平的顯著增高。同時,我們發(fā)現(xiàn)細胞惡性轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了MSK1/H3S10p通路下游靶基因c-fos, c-jun和jund的不同程度上調(diào),提示組蛋白磷酸化異�？赡軈⑴c細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中重要基因的調(diào)控。我們對組蛋白H4乙�；綇V泛下調(diào)的研究顯示：引起乙酰化下調(diào)的主要修飾酶是組蛋白去乙�；窰DAC1,其蛋白和mRNA水平以及酶活性在惡性轉(zhuǎn)化細胞中均發(fā)生上調(diào)；抑制HDAC1的活性能顯著恢復(fù)H4K16的乙酰化水平。此外,我們還發(fā)現(xiàn)HDAC6的表達水平也發(fā)生了上調(diào),其重要底物α-tubulin的乙酰化水平降低,抑制HDAC6表達可逆轉(zhuǎn)α-tubulin的低乙�；＿M一步研究組蛋白乙�；惓？赡苡绊懙陌谢�,我們發(fā)現(xiàn)抑癌基因FHIT在致癌物暴露后早期即發(fā)生顯著下調(diào)。深入研究表明：該基因不存在純合性缺失,其啟動子區(qū)H4乙酰化水平明顯降低,而DNA甲基化水平卻顯著增高。我們的結(jié)果表明包括DNA甲基化和組蛋白修飾在內(nèi)的表觀遺傳機制參與了細胞惡性變過程中FHIT基因的表達調(diào)控。為進一步明確上述組蛋白修飾通路異常對惡性變細胞的影響,我們分別單獨或聯(lián)合使用MSK1抑制劑、HDAC抑制劑和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對惡性變細胞的惡性表型進行研究,發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾改變可顯著抑制惡性表型。綜上所述,我們研究了MNNG和MNU誘導(dǎo)人胃粘膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中組蛋白異常修飾的調(diào)控機理及可能作用。研究結(jié)果為闡明NOC類致癌物誘發(fā)細胞惡性變、甚至胃癌發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機制提供了重要依據(jù),并為胃癌等腫瘤的早期診斷與治療提供了新的思路和線索。
【關(guān)鍵詞】：N-亞硝胺類致癌物(NOC) MNU MNNG 細胞惡性轉(zhuǎn)化 組蛋白修飾 表觀遺傳
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R573
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略語10-13
• 1 引言13-17
• 2 實驗材料與方法17-36
• 2.1 實驗材料17-24
• 2.1.1 細胞系17
• 2.1.2 細胞培養(yǎng)試劑及溶液17
• 2.1.3 細胞轉(zhuǎn)染試劑17-18
• 2.1.4 細胞處理物18
• 2.1.5 細胞蛋白提取試劑18
• 2.1.6 BSA蛋白定量法相關(guān)試劑18
• 2.1.7 Western blot相關(guān)試劑和溶液18-20
• 2.1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗相關(guān)試劑20-22
• 2.1.9 PCR相關(guān)試劑22
• 2.1.10 引物22-24
• 2.1.11 SiRNA24
• 2.2 實驗方法24-36
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)與處理24
• 2.2.2 細胞轉(zhuǎn)染24
• 2.2.3 實時熒光定量PCR24-26
• 2.2.4 常規(guī)PCR26-27
• 2.2.5 免疫印跡實驗(western blot)27-28
• 2.2.6 免疫熒光28-29
• 2.2.7 流式細胞檢測29
• 2.2.8 亞硫酸氫鹽測序(委托公司檢測)29-32
• 2.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)32-34
• 2.2.10 組蛋白去乙�；窰DACs酶活性的測定34
• 2.2.11 軟瓊脂克隆形成實驗(soft agar)34-35
• 2.2.12 統(tǒng)計學(xué)分析35-36
• 3 結(jié)果36-52
• 3.1 檢測MNNG和MNU誘導(dǎo)人胃粘膜上皮細胞GES-1惡性轉(zhuǎn)化模型36-37
• 3.2 初步篩選惡性轉(zhuǎn)化細胞中組蛋白修飾的差異改變37-39
• 3.3 組蛋白H3S10磷酸化在細胞惡性轉(zhuǎn)化中的上調(diào)機制及作用研究39-44
• 3.3.1 進一步驗證H3S10p在惡性轉(zhuǎn)化細胞中的上調(diào)39-40
• 3.3.2 明確引起H3S10磷酸化上調(diào)的上游激酶40-43
• 3.3.3 初步篩選組蛋白H3S10磷酸化上調(diào)所調(diào)控的下游靶基因43
• 3.3.4 抑制MSK1-H3S10p通路對細胞惡性表型的影響43-44
• 3.4 組蛋白H4賴氨酸乙酰化在細胞惡性轉(zhuǎn)化中的下調(diào)機制及作用研究44-50
• 3.4.1 介導(dǎo)組蛋白H4賴氨酸乙�；抡{(diào)的主要去乙酰化酶44-47
• 3.4.2 組蛋白H4賴氨酸乙�；抡{(diào)參與了抑癌基因FHIT的表觀遺傳沉默47-49
• 3.4.3 抑制組蛋白去乙酰化和α-tubulin去乙�；瘜毎麗盒员硇偷挠绊�49-50
• 3.5 多種抑制劑單獨或聯(lián)合作用對細胞惡性表型的影響50-52
• 4 討論52-58
• 5 結(jié)論和展望58-60
• 5.1 主要結(jié)論58
• 5.2 展望58-60
• 參考文獻60-65
• 綜述65-74
• 參考文獻69-74
• 作者簡歷及在學(xué)期間取得的科研成果74
• 1、作者簡歷74
• 2、參加課題74
• 3、發(fā)表論文情況74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Stefania Nobili;Lorenzo Bruno;Ida Landini;Cristina Napoli;Paolo Bechi;Francesco Tonelli;Carlos A Rubio;Enrico Mini;Gabriella Nesi;;Genomic and genetic alterations influence the progression of gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2011年03期

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本文編號：1053816