本文關(guān)鍵詞：PTP1B在肝纖維化形成及逆轉(zhuǎn)過程中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 肝纖維化 逆轉(zhuǎn) 肝星狀細(xì)胞 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B

【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是多種慢性致病因子作用于肝臟后,引起的以細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM)沉積為主要特征的可逆性損傷修復(fù)反應(yīng)。持續(xù)的肝纖維化是肝硬化和肝癌的主要病因。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化是肝纖維化的發(fā)生發(fā)展的核心事件。研究表明,當(dāng)去除病因后,肝纖維化可以自發(fā)逆轉(zhuǎn),其逆轉(zhuǎn)的主要機(jī)制主要是活化的HSCs凋亡和失活。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)是一種廣泛表達(dá)的、經(jīng)典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,由蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1, PTPN1)基因編碼表達(dá)。研究顯示,PTP1B在肝臟再生、急性肝損傷、脂肪肝等肝臟疾病當(dāng)中,發(fā)揮重要作用。但是其在肝纖維化中的作用還未見報(bào)道。為了深入研究PTP1B在肝纖維化中的作用,本課題首先檢測(cè)了其在肝纖維化進(jìn)展期及逆轉(zhuǎn)期肝組織的表達(dá)變化。并選用HSC-T6細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別檢測(cè)PTP1B在HSC活化及逆轉(zhuǎn)失活過程中的表達(dá)變化及作用。本文主要研究內(nèi)容包括下面三個(gè)部分：1. PTP1B在肝纖維化形成及逆轉(zhuǎn)過程中的變化36只昆明小鼠(雄性,4周齡,20-22g),隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和肝纖維化逆轉(zhuǎn)組,每組12只。模型組小鼠腹腔注射20% CCl4橄欖油溶液(0.01 ml/g)以建立肝纖維化模型,每周2次,共4周；逆轉(zhuǎn)組小鼠在注射CCl4達(dá)4周后,停止注射并正常飼養(yǎng)6周以建立肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型；正常對(duì)照組則以同樣方法注射等量橄欖油。于CCl4停止注射后0、6周分別處死小鼠,收集血清、肝臟標(biāo)本待用。HE染色和Masson染色觀察肝臟病理改變,并檢測(cè)血清ALT和AST水平觀察肝臟損傷程度。應(yīng)用Real-time PCR、Western Blot、。免疫組化及免疫熒光檢測(cè)PTP1B的表達(dá)和定位情況。結(jié)果顯示：PTP1B在肝纖維化肝組織中表達(dá)上調(diào),而在纖維化自發(fā)恢復(fù)后表達(dá)降低,且PTP1B主要表達(dá)于活化的肝星狀細(xì)胞中。2. PTP1B對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6舌化增殖的影響HSC-T6細(xì)胞經(jīng)不同梯度濃度(0、5、10、15ng/ml；24h)的、不同時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、48h；10ng/m1)的TGF-β1刺激活化,采用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)PTP1B在活化的HSC中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：PTP1B在TGF-p1誘導(dǎo)活化的HSC-T6中表達(dá)上調(diào),并呈劑量/時(shí)間依賴性。應(yīng)用PTP1B-siRNA預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞6h后,再給予TGF-p1(10ng/ml)作用24 h,運(yùn)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中Co11αl和a-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：沉默PTP1B可以抑制TGF-p1誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,但是不影響細(xì)胞的凋亡情況；沉默PTP1B可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的活化,降低Co11αl和α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3. PTP1B對(duì)MDI誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6失活的影響HSC-T6細(xì)胞以TGF-β1(10ng/ml,24h)誘導(dǎo)活化后,除去培養(yǎng)基,更換為含有MDI的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)PTP1B在逆轉(zhuǎn)失活的HSC中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：PTP1B在TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6中表達(dá)上調(diào),在MDI誘導(dǎo)失活的HSC-T6中表達(dá)下調(diào)。HSC-T6細(xì)胞以TGF-β1(10ng/ml,24h)活化后,將pCDA3.1-PTP1B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,6h后更換為含MDI的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中Collα1和a-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：過表達(dá)PTP1B可拮抗MDI誘導(dǎo)的HSC-T6的失活,恢復(fù)Collα1和a-SMA的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 逆轉(zhuǎn) 肝星狀細(xì)胞 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-20
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞15
• 2.2 主要試劑15-17
• 2.3 儀器與設(shè)備17-18
• 2.4 主要試劑和溶液的配制18-20
• 3 實(shí)驗(yàn)方法20-36
• 3.1 小鼠動(dòng)物模型的建立20
• 3.2 小鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)20-22
• 3.3 免疫組化22
• 3.4 免疫熒光雙染22-23
• 3.5 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量測(cè)定(微板法)23-24
• 3.6 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量測(cè)定(微板法)24-25
• 3.7 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)和傳代25
• 3.8 MDI誘導(dǎo)已活化的HSC-T6細(xì)胞失活25
• 3.9 PTP1B-siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T625-26
• 3.10 pCDNA3.1 Flag-rat-PTP1B轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞26-28
• 3.11 MTT試驗(yàn)28
• 3.12 細(xì)胞周期檢測(cè)(Propidium染色法)28-29
• 3.13 細(xì)胞凋亡檢測(cè)(Annexin V-FITC/PI雙染法)29-30
• 3.14 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)30-32
• 3.15 Western Blot實(shí)驗(yàn)32-35
• 3.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理35-36
• 4 結(jié)果36-56
• 4.1 PTP1B在纖維化肝組織及逆轉(zhuǎn)肝組織中的表達(dá)變化36-41
• 4.2 PTP1B在活化的HSC-T6中的表達(dá)水平41-44
• 4.3 PTP1B-siRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖的影響44-47
• 4.4 PTP1B-siRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化的影響47-49
• 4.5 PTP1B在MDI誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)的HSC-T6中的表達(dá)變化49-52
• 4.6 pCDNA3.1-PTP1B質(zhì)粒對(duì)MDI誘導(dǎo)的HSC-T6失活的影響52-56
• 5 討論56-59
• 6 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-66
• 致謝66-67
• 綜述67-98
• References89-98

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