人參皂苷Rh-2抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的研究
發(fā)布時(shí)間：2014-10-09 19:56
【摘要】 目的：觀察人參皂苷Rh2對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,并初步闡明其分子機(jī)制。方法：采用MTT比色法觀察人參皂苷Rh2(G-Rh2)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)細(xì)胞系kb細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀和Hoechest染色法分別檢測(cè)G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞凋亡的影響；采用Transwell小室內(nèi)Matrigel膠重建基底膜實(shí)驗(yàn)觀察G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞侵襲能力的影響；采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞體外遷移能力的影響；采用明膠酶譜法檢測(cè)G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響；采用細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光探針DCFH-DA檢測(cè)G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平的影響；采用ELESE試劑盒檢測(cè)G-Rh2對(duì)kb細(xì)胞內(nèi)VEGF水平的影響。結(jié)果：(1)人參皂苷Rh-210、20、40、60、80μg/mL時(shí),對(duì)Kb細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為16.4%、21.2%、28.1%、30.2%、31.8%;10、20、40μg/mL G-Rh2處理后侵襲細(xì)胞數(shù)分別降低到65.4%,43.2%,16.9%(P<0.01)；劃痕愈合度分別為19.5%,10.5%,8.8%,對(duì)Kb細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用。(2)人參皂苷Rh-2對(duì)Kb細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的抑制作用較明顯,濃度在40μg/ml時(shí)幾乎可完全抑制；人參皂苷Rh-2可清除Kb細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧,抑制Kb細(xì)胞分泌VEGF,從而抑制腫瘤血管的生成。結(jié)論：人參皂苷Rh2作為人參天然活性成分之一,可抑制人口腔鱗癌Kb細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移且呈劑量依賴性,可通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的活性以及抑制血管新生而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】 人參皂苷Rh-2； 口腔鱗狀細(xì)胞癌； 侵襲； 轉(zhuǎn)移；
第一章研究背景
人參是我國(guó)傳統(tǒng)的寶貴中草藥材。此中重要身分是人參皂苷和人參多糖，人參皂苷約占4%。人參的藥理活性范疇非常遍及不但對(duì)中樞神經(jīng)、心血管、免疫、內(nèi)排泄體系具有藥理作用，還體現(xiàn)出抗腫瘤、抗應(yīng)激、抗氧化活性[2'33。本文重要對(duì)人參中重要活性身分人參皂甙Rh2的藥理作用舉行綜述。
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1.1人參皂甙Rh2發(fā)現(xiàn)
人參皂甙Rh2是從紅參中提取的自然活性身分，分子量為622，分子式為C36H6208,化學(xué)名為20(S)—人參二醇一3—氧一 0 — D—吡喃葡萄糖苷。1983年，日本學(xué)者北川勛初次從朝鮮紅參中分散出20 (R)-人參皂苷Rg3和20 (S)-人參皂苷Rg3，而人參阜苷Rh2為20 (R)-人參阜苷Rg3降解產(chǎn)品，研究評(píng)釋，紅參中特有的人參皂昔Rh2在白參中險(xiǎn)些沒有。這闡明人參皂苷Rg3和Rh2是在白參蒸制成紅參的歷程中天生的次生皂苷。
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1.2人參皂苷Rh2的抗腫瘤作用
1.2. 1抗腫瘤
腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要特性在于分解停滯，因此，惡性腫瘤被看作是細(xì)胞分解非常的疾病。分解非常后，返回原始胚胎細(xì)胞表型，即去分解。邇來的研究評(píng)釋，引起細(xì)胞分解阻抑特異性的基因轉(zhuǎn)變?cè)诳隙l件下是可逆的，從自然化合物中探求分解誘導(dǎo)劑成為學(xué)者們研究的重點(diǎn)細(xì)胞凋亡是一個(gè)步伐化去世亡的歷程，其與腫瘤產(chǎn)生、生長(zhǎng)及其對(duì)治療因子的反響干系親昵。比年來，人們漸漸了解到腫瘤細(xì)胞周期停滯、凋亡可克制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，減輕病灶四周炎癥反響，成為惡性腫瘤化療的新目的。大量研究評(píng)釋，人參皂甙Rh2抗腫瘤作用與傳統(tǒng)的化療藥物有所差別，深入研究的抗腫瘤作用機(jī)制具有重要的實(shí)際意義。
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第二章人參皂苷Rii-2抗Kb細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用研究
2.1引言
口腔鱗狀細(xì)胞癌為常見的口腔惡性腫瘤，生長(zhǎng)快，轉(zhuǎn)移率高，本實(shí)驗(yàn)選取人口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC)細(xì)胞系kb細(xì)胞研究對(duì)象，采用mr比色法觀察不同濃度人參皂苷Rh2 (G-Rh2)作用后對(duì)kb細(xì)胞增殖的影響；采用Hoechst 33342染色法和流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞凋亡的影響；采用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞周期的影響；采用Transwell小室內(nèi)Matrigel膠重建基底膜實(shí)驗(yàn)觀察G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞侵襲能力的影響；采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察G-Rh2對(duì)Kb細(xì)胞體外遷移能力的影響。
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2.2實(shí)驗(yàn)材料
2.2.1細(xì)胞株
人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Kb細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTC，武漢）
2.2.2主要試劑
人參皂苷Rh2 中國(guó)藥品生物制品檢定所
RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)Sigma公司
胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有公司
Hoechst 33342 美國(guó)Sigma公司
DMSO 美國(guó)Sigma公司
人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel膠 美國(guó)BD公司
Transwell小室（孔徑Stim) 美國(guó)Millipore公司
胰蛋白酶 美國(guó)美國(guó)Sigma公司
注射用鏈霉素 山東瑞陽制藥有限公司
注射用青霉素鈉 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司
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第三章 人參皂苷RH-2體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理研究.............. 27-38
3.1 引言..................... 27
3.2 實(shí)驗(yàn)材料 .......................27-29
3.3 實(shí)驗(yàn)方法 ................................29-33
3.3.1 主要試劑配制 ........................29-31
3.3.2 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇................. 31
3.3.3 明膠酶譜分析實(shí)驗(yàn).................... 31
3.3.4 Kb細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè) ..........................31-32
3.3.5 VEGF蛋白水平的測(cè)定 ..............32-33
3.3.6 數(shù)據(jù)分析......................... 33
3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ......................33-36
3.4.1 人參皂苷Rh-2對(duì)Kb細(xì)胞中MMP-2活性的影響 ......................33-34
3.4.2 人參皂苷Rh2對(duì)Kb細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響 .....................34-35
3.4.3 人參皂苷Rh-2對(duì)Kb細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響 ..................35-36
3.5討論
基底膜（basement membrane, BM) 和細(xì)胞外基質(zhì)（extraeelhiarmatix，ECM)組成的構(gòu)造學(xué)屏蔽，在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有緊張作用，腫瘤細(xì)胞能排泄如MMP的卵白酶類可降解這種屏蔽，通過MMP-2降解卵白出現(xiàn)負(fù)染條帶的面積和亮度來權(quán)衡MMP-2的活力。效果表現(xiàn)，人參皂苷Rh-2在20^ig/mL和40^ig/mL G-Rh2組分別低落到52.1%, 50.2%均可克制腫瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)量，從而可限定腫瘤細(xì)胞突破其構(gòu)造屏蔽，進(jìn)一步限定腫瘤細(xì)胞在相近構(gòu)造侵襲。大多數(shù)學(xué)者證明[5G]，MMP- 2險(xiǎn)些可降解細(xì)胞外基質(zhì)的全部身分，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移親昵相干，并且血管復(fù)活在很大水平上又依賴于基質(zhì)金屬卵白酶的活性。腫瘤細(xì)胞的快速增生可致使局部缺氧，缺氧情況導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量排泄VEGF并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞排泄MMP-2，而MMP-2又能上調(diào)腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)其更有用的和受體聯(lián)合誘導(dǎo)血管天生，陳衛(wèi)民[51]等實(shí)行MMP-2和VEGF兩者相互和諧促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，從而有用的克制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。人參皂苷Rh-2大概通過克制MMP-2的表達(dá)，從而克制血管天生。
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結(jié)論
本論文以人口腔鱗狀細(xì)胞癌系Kb細(xì)胞為研究對(duì)象，建立了人參皂苷Rh2抑制空腔鱗癌轉(zhuǎn)移和侵襲的模型，結(jié)果表明：
1)人參皂苷Rh-2在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能抑制kb細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其發(fā)生凋亡，并對(duì)Kb細(xì)胞周期有明顯影響，使細(xì)胞周期停滯于G2 — M期，減少DNA合成和有絲分裂，從而影響細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
2)人參皂-苷Rh-2在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，能夠有效抑制口腔鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲和腫瘤內(nèi)部血管新生，在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)上產(chǎn)生拮抗作用，是一個(gè)有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。
3)人參皂苷Rh-2通過清除活性氧，有效改善腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的活性和表達(dá)，是其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理之一。
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本文編號(hào)：9535
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