人參皂苷Rh-2抑制口腔鱗癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究
發(fā)布時間：2014-10-09 19:56
【摘要】 目的：觀察人參皂苷Rh2對口腔鱗癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,并初步闡明其分子機制。方法：采用MTT比色法觀察人參皂苷Rh2(G-Rh2)對口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)細胞系kb細胞增殖的影響；采用流式細胞儀和Hoechest染色法分別檢測G-Rh2對Kb細胞凋亡的影響；采用Transwell小室內Matrigel膠重建基底膜實驗觀察G-Rh2對Kb細胞侵襲能力的影響；采用劃痕實驗觀察G-Rh2對Kb細胞體外遷移能力的影響；采用明膠酶譜法檢測G-Rh2對Kb細胞MMP-2表達的影響；采用細胞內活性氧熒光探針DCFH-DA檢測G-Rh2對Kb細胞胞內活性氧水平的影響；采用ELESE試劑盒檢測G-Rh2對kb細胞內VEGF水平的影響。結果：(1)人參皂苷Rh-210、20、40、60、80μg/mL時,對Kb細胞的生長抑制率分別為16.4%、21.2%、28.1%、30.2%、31.8%;10、20、40μg/mL G-Rh2處理后侵襲細胞數(shù)分別降低到65.4%,43.2%,16.9%(P<0.01)；劃痕愈合度分別為19.5%,10.5%,8.8%,對Kb細胞的遷移有明顯的抑制作用。(2)人參皂苷Rh-2對Kb細胞中MMP-2表達的抑制作用較明顯,濃度在40μg/ml時幾乎可完全抑制；人參皂苷Rh-2可清除Kb細胞內產(chǎn)生的活性氧,抑制Kb細胞分泌VEGF,從而抑制腫瘤血管的生成。結論：人參皂苷Rh2作為人參天然活性成分之一,可抑制人口腔鱗癌Kb細胞的增殖、侵襲及轉移且呈劑量依賴性,可通過抑制腫瘤細胞分泌基質金屬蛋白酶的活性以及抑制血管新生而抑制腫瘤轉移。
第一章研究背景
人參是我國傳統(tǒng)的寶貴中草藥材。此中重要身分是人參皂苷和人參多糖，人參皂苷約占4%。人參的藥理活性范疇非常遍及不但對中樞神經(jīng)、心血管、免疫、內排泄體系具有藥理作用，還體現(xiàn)出抗腫瘤、抗應激、抗氧化活性[2'33。本文重要對人參中重要活性身分人參皂甙Rh2的藥理作用舉行綜述。
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1.1人參皂甙Rh2發(fā)現(xiàn)
人參皂甙Rh2是從紅參中提取的自然活性身分，分子量為622，分子式為C36H6208,化學名為20(S)—人參二醇一3—氧一 0 — D—吡喃葡萄糖苷。1983年，日本學者北川勛初次從朝鮮紅參中分散出20 (R)-人參皂苷Rg3和20 (S)-人參皂苷Rg3，而人參阜苷Rh2為20 (R)-人參阜苷Rg3降解產(chǎn)品，研究評釋，紅參中特有的人參皂昔Rh2在白參中險些沒有。這闡明人參皂苷Rg3和Rh2是在白參蒸制成紅參的歷程中天生的次生皂苷。
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1.2人參皂苷Rh2的抗腫瘤作用
1.2. 1抗腫瘤
腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的一個重要特性在于分解停滯，因此，惡性腫瘤被看作是細胞分解非常的疾病。分解非常后，返回原始胚胎細胞表型，即去分解。邇來的研究評釋，引起細胞分解阻抑特異性的基因轉變在肯定條件下是可逆的，從自然化合物中探求分解誘導劑成為學者們研究的重點細胞凋亡是一個步伐化去世亡的歷程，其與腫瘤產(chǎn)生、生長及其對治療因子的反響干系親昵。比年來，人們漸漸了解到腫瘤細胞周期停滯、凋亡可克制實體瘤的生長，減輕病灶四周炎癥反響，成為惡性腫瘤化療的新目的。大量研究評釋，人參皂甙Rh2抗腫瘤作用與傳統(tǒng)的化療藥物有所差別，深入研究的抗腫瘤作用機制具有重要的實際意義。
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第二章人參皂苷Rii-2抗Kb細胞轉移作用研究
2.1引言
口腔鱗狀細胞癌為常見的口腔惡性腫瘤，生長快，轉移率高，本實驗選取人口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC)細胞系kb細胞研究對象，采用mr比色法觀察不同濃度人參皂苷Rh2 (G-Rh2)作用后對kb細胞增殖的影響；采用Hoechst 33342染色法和流式細胞分析儀檢測G-Rh2對Kb細胞凋亡的影響；采用流式細胞分析儀檢測G-Rh2對Kb細胞周期的影響；采用Transwell小室內Matrigel膠重建基底膜實驗觀察G-Rh2對Kb細胞侵襲能力的影響；采用劃痕實驗觀察G-Rh2對Kb細胞體外遷移能力的影響。
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2.2實驗材料
2.2.1細胞株
人口腔鱗狀細胞癌細胞系Kb細胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTC，武漢）
2.2.2主要試劑
人參皂苷Rh2 中國藥品生物制品檢定所
RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Sigma公司
胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有公司
Hoechst 33342 美國Sigma公司
DMSO 美國Sigma公司
人工重構基底膜材料Matrigel膠 美國BD公司
Transwell小室（孔徑Stim) 美國Millipore公司
胰蛋白酶 美國美國Sigma公司
注射用鏈霉素 山東瑞陽制藥有限公司
注射用青霉素鈉 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司
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第三章 人參皂苷RH-2體外抗腫瘤轉移的分子機理研究.............. 27-38
3.1 引言..................... 27
3.2 實驗材料 .......................27-29
3.3 實驗方法 ................................29-33
3.3.1 主要試劑配制 ........................29-31
3.3.2 細胞凍存、復蘇................. 31
3.3.3 明膠酶譜分析實驗.................... 31
3.3.4 Kb細胞內活性氧檢測 ..........................31-32
3.3.5 VEGF蛋白水平的測定 ..............32-33
3.3.6 數(shù)據(jù)分析......................... 33
3.4 實驗結果 ......................33-36
3.4.1 人參皂苷Rh-2對Kb細胞中MMP-2活性的影響 ......................33-34
3.4.2 人參皂苷Rh2對Kb細胞內活性氧的影響 .....................34-35
3.4.3 人參皂苷Rh-2對Kb細胞內血管內皮生長因子(VEGF)的影響 ..................35-36
3.5討論
基底膜（basement membrane, BM) 和細胞外基質（extraeelhiarmatix，ECM)組成的構造學屏蔽，在腫瘤轉移中具有緊張作用，腫瘤細胞能排泄如MMP的卵白酶類可降解這種屏蔽，通過MMP-2降解卵白出現(xiàn)負染條帶的面積和亮度來權衡MMP-2的活力。效果表現(xiàn)，人參皂苷Rh-2在20^ig/mL和40^ig/mL G-Rh2組分別低落到52.1%, 50.2%均可克制腫瘤細胞MMP-2的表達量，從而可限定腫瘤細胞突破其構造屏蔽，進一步限定腫瘤細胞在相近構造侵襲。大多數(shù)學者證明[5G]，MMP- 2險些可降解細胞外基質的全部身分，與腫瘤的侵襲和轉移親昵相干，并且血管復活在很大水平上又依賴于基質金屬卵白酶的活性。腫瘤細胞的快速增生可致使局部缺氧，缺氧情況導致腫瘤細胞大量排泄VEGF并誘導內皮細胞排泄MMP-2，而MMP-2又能上調腫瘤血管內皮生長因子的表達，促進其更有用的和受體聯(lián)合誘導血管天生，陳衛(wèi)民[51]等實行MMP-2和VEGF兩者相互和諧促進腫瘤的侵襲及轉移，從而有用的克制腫瘤細胞的轉移。人參皂苷Rh-2大概通過克制MMP-2的表達，從而克制血管天生。
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結論
本論文以人口腔鱗狀細胞癌系Kb細胞為研究對象，建立了人參皂苷Rh2抑制空腔鱗癌轉移和侵襲的模型，結果表明：
1)人參皂苷Rh-2在實驗濃度范圍內能抑制kb細胞的增殖，促進其發(fā)生凋亡，并對Kb細胞周期有明顯影響，使細胞周期停滯于G2 — M期，減少DNA合成和有絲分裂，從而影響細胞周期阻滯和細胞生長抑制。
2)人參皂-苷Rh-2在實驗濃度范圍內，能夠有效抑制口腔鱗癌細胞的遷移、侵襲和腫瘤內部血管新生，在腫瘤轉移的多個環(huán)節(jié)上產(chǎn)生拮抗作用，是一個有效的抗腫瘤轉移藥物。
3)人參皂苷Rh-2通過清除活性氧，有效改善腫瘤轉移相關因子的活性和表達，是其抗腫瘤轉移的作用機理之一。
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本文編號：9535
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