本文關(guān)鍵詞：角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用

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【摘要】：目的:探討正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平、Nrf2-ARE信號(hào)通路活化的區(qū)別,及其對(duì)角膜基質(zhì)降解酶表達(dá)水平的影響。方法:1、收集2012年11月至2013年6月在青島眼科醫(yī)院行角膜移植的圓錐角膜患者的角膜樣本,以及供體正常的旁中央角膜樣本,用Dispase和collagenase聯(lián)合消化法,組織塊分離培養(yǎng)正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞,培養(yǎng)液均為DMEM/F-12(含10%胎牛血清),傳代限制在P4以?xún)?nèi),采用200μM H2O2處理模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境。2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定不同培養(yǎng)條件,將正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞分為4組:①正常角膜對(duì)照組(HCF-CON):正常角膜基質(zhì)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);②正常角膜氧化應(yīng)激組(HCF-H2O2):采用200μM H2O2處理正常角膜基質(zhì)細(xì)胞;③圓錐角膜對(duì)照組(KCF-CON):圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);④圓錐角膜氧化應(yīng)激組(KCF-H2O2):采用200μM H2O2處理圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞。3、細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的活性采用DCFH-DA熒光底物孵育法檢測(cè)。4、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白、Nrf2-ARE信號(hào)通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纖溶酶原激活物系統(tǒng)表達(dá)水平分別采用免疫蛋白印跡(Western blot)法和實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time qPCR)方法進(jìn)行檢測(cè)。5、細(xì)胞離心沉淀和培養(yǎng)基上清中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性采用明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果:1、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞;經(jīng)體外氧化應(yīng)激刺激后,兩組ROS熒光強(qiáng)度均有增強(qiáng),但圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞。2、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞(t=18.155,P0.01);在H2O2處理?xiàng)l件下,正常角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位表達(dá)水平明顯增高(t=50.867,P0.01),但圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位表達(dá)水平受到抑制(t=62.123,P0.01)。3、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化基因還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原酶1(NQO-1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NQO-1:t=9.315,P0.01;HO-1:t=13.555,P0.01;SOD2:t=7.379,P0.01)。在H2O2處理?xiàng)l件下,Nrf2-ARE信號(hào)通路下游基因NQO-1、HO-1、SOD2表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化(NQO-1:t=2.209,P=0.092;HO-1:t=0.293,P=0.784;SOD2:t=0.749,P=0.495)。4、在任何處理?xiàng)l件下,圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、uPA受體(uPAR)表達(dá)量和MMP-2活性均明顯高于正常細(xì)胞(uPA:t=19.164,P0.01;uPAR:t=15.458,P0.01;MMP-2:t=4.818,P0.01)。結(jié)論:圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞在Nrf2-ARE信號(hào)通路活化方面存在缺陷,且這種缺陷與其表達(dá)基質(zhì)降解酶的水平密切相關(guān),說(shuō)明該通路異�？赡苁菆A錐角膜發(fā)病的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：圓錐角膜 核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路 角膜基質(zhì)細(xì)胞 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 縮略詞表2-3
• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 引言9-11
• 第一章 資料與方法11-30
• 1.1 實(shí)驗(yàn)樣本11
• 1.1.1 樣本來(lái)源11
• 1.1.2 樣本分組11
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材11-13
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器11-12
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)耗材12-13
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及主要溶液配制13-16
• 1.3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑13-14
• 1.3.2 待測(cè)基因的PCR引物序列14-15
• 1.3.3 主要溶液的配制15-16
• 1.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞（HCF）和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞（KCF）的傳代培養(yǎng)及處理16-18
• 1.4.1 原代角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)步驟16
• 1.4.2 角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代16-17
• 1.4.3 角膜基質(zhì)細(xì)胞的凍存17
• 1.4.4 角膜基質(zhì)細(xì)胞的復(fù)蘇17-18
• 1.4.5 模擬氧化應(yīng)激條件的處理18
• 1.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）檢測(cè)18
• 1.6 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)法18-21
• 1.6.1 樣品制備18
• 1.6.2 總RNA的提取18-19
• 1.6.3 測(cè)定RNA濃度19
• 1.6.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈19-20
• 1.6.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)20-21
• 1.7 Western Blot檢測(cè)法21-25
• 1.7.1 細(xì)胞總蛋白的提取21
• 1.7.2 細(xì)胞核-質(zhì)蛋白的分離提取21-22
• 1.7.3 BCA法測(cè)蛋白濃度22-23
• 1.7.4 配制SDS-PAGE凝膠23-24
• 1.7.5 加樣及電泳24
• 1.7.6 濕法轉(zhuǎn)膜24
• 1.7.7 免疫反應(yīng)（目的蛋白特異性結(jié)合抗體）24-25
• 1.8 明膠酶譜技術(shù)25-28
• 1.8.1 實(shí)驗(yàn)用試劑的配制25-27
• 1.8.2 樣本的收集27
• 1.8.3 加樣與電泳27-28
• 1.8.4 明膠酶譜反應(yīng)28
• 1.8.5 明膠酶譜的保存28
• 1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法28-30
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-38
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)31
• 2.3 細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白水平檢測(cè)31-32
• 2.4 Nrf2-ARE信號(hào)通路下游抗氧化蛋白表達(dá)檢測(cè)32-35
• 2.5 基質(zhì)降解相關(guān)蛋白的檢測(cè)35-38
• 第三章 討論38-40
• 第四章 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述43-53
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果53-54
• 致謝54-55

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