本文關鍵詞：角膜基質細胞Nrf2-ARE信號通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用

  更多相關文章： 圓錐角膜 核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件信號通路 角膜基質細胞 氧化應激

【摘要】：目的:探討正常角膜和圓錐角膜基質細胞中氧化應激水平、Nrf2-ARE信號通路活化的區(qū)別,及其對角膜基質降解酶表達水平的影響。方法:1、收集2012年11月至2013年6月在青島眼科醫(yī)院行角膜移植的圓錐角膜患者的角膜樣本,以及供體正常的旁中央角膜樣本,用Dispase和collagenase聯(lián)合消化法,組織塊分離培養(yǎng)正常角膜和圓錐角膜基質細胞,培養(yǎng)液均為DMEM/F-12(含10%胎牛血清),傳代限制在P4以內,采用200μM H2O2處理模擬氧化應激微環(huán)境。2、根據(jù)實驗需要設定不同培養(yǎng)條件,將正常角膜和圓錐角膜基質細胞分為4組:①正常角膜對照組(HCF-CON):正常角膜基質細胞常規(guī)培養(yǎng);②正常角膜氧化應激組(HCF-H2O2):采用200μM H2O2處理正常角膜基質細胞;③圓錐角膜對照組(KCF-CON):圓錐角膜基質細胞常規(guī)培養(yǎng);④圓錐角膜氧化應激組(KCF-H2O2):采用200μM H2O2處理圓錐角膜基質細胞。3、細胞內活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的活性采用DCFH-DA熒光底物孵育法檢測。4、細胞核內Nrf2蛋白、Nrf2-ARE信號通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纖溶酶原激活物系統(tǒng)表達水平分別采用免疫蛋白印跡(Western blot)法和實時定量PCR(Real-time qPCR)方法進行檢測。5、細胞離心沉淀和培養(yǎng)基上清中基質金屬蛋白酶(MMPs)活性采用明膠酶譜技術檢測。結果:1、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質細胞中ROS熒光強于正常角膜基質細胞;經(jīng)體外氧化應激刺激后,兩組ROS熒光強度均有增強,但圓錐角膜基質細胞中ROS熒光強度明顯強于正常角膜基質細胞。2、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質細胞核內Nrf2蛋白表達水平明顯高于正常角膜基質細胞(t=18.155,P0.01);在H2O2處理條件下,正常角膜基質細胞Nrf2核轉位表達水平明顯增高(t=50.867,P0.01),但圓錐角膜基質細胞Nrf2核轉位表達水平受到抑制(t=62.123,P0.01)。3、正常培養(yǎng)條件下,圓錐角膜基質細胞抗氧化基因還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原酶1(NQO-1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA表達和蛋白表達水平顯著低于正常角膜基質細胞,差異均有統(tǒng)計學意義(NQO-1:t=9.315,P0.01;HO-1:t=13.555,P0.01;SOD2:t=7.379,P0.01)。在H2O2處理條件下,Nrf2-ARE信號通路下游基因NQO-1、HO-1、SOD2表達量未見明顯變化(NQO-1:t=2.209,P=0.092;HO-1:t=0.293,P=0.784;SOD2:t=0.749,P=0.495)。4、在任何處理條件下,圓錐角膜基質細胞尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、uPA受體(uPAR)表達量和MMP-2活性均明顯高于正常細胞(uPA:t=19.164,P0.01;uPAR:t=15.458,P0.01;MMP-2:t=4.818,P0.01)。結論:圓錐角膜基質細胞在Nrf2-ARE信號通路活化方面存在缺陷,且這種缺陷與其表達基質降解酶的水平密切相關,說明該通路異�？赡苁菆A錐角膜發(fā)病的機制之一。
【關鍵詞】：圓錐角膜 核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件信號通路 角膜基質細胞 氧化應激
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 縮略詞表2-3
• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 引言9-11
• 第一章 資料與方法11-30
• 1.1 實驗樣本11
• 1.1.1 樣本來源11
• 1.1.2 樣本分組11
• 1.2 實驗儀器與耗材11-13
• 1.2.1 實驗儀器11-12
• 1.2.2 實驗耗材12-13
• 1.3 實驗試劑及主要溶液配制13-16
• 1.3.1 主要實驗試劑13-14
• 1.3.2 待測基因的PCR引物序列14-15
• 1.3.3 主要溶液的配制15-16
• 1.4 人角膜基質細胞（HCF）和圓錐角膜基質細胞（KCF）的傳代培養(yǎng)及處理16-18
• 1.4.1 原代角膜基質細胞的培養(yǎng)步驟16
• 1.4.2 角膜基質細胞的傳代16-17
• 1.4.3 角膜基質細胞的凍存17
• 1.4.4 角膜基質細胞的復蘇17-18
• 1.4.5 模擬氧化應激條件的處理18
• 1.5 細胞內活性氧自由基（ROS）檢測18
• 1.6 實時定量PCR（RT-qPCR）檢測法18-21
• 1.6.1 樣品制備18
• 1.6.2 總RNA的提取18-19
• 1.6.3 測定RNA濃度19
• 1.6.4 反轉錄合成cDNA第一鏈19-20
• 1.6.5 熒光實時定量PCR技術20-21
• 1.7 Western Blot檢測法21-25
• 1.7.1 細胞總蛋白的提取21
• 1.7.2 細胞核-質蛋白的分離提取21-22
• 1.7.3 BCA法測蛋白濃度22-23
• 1.7.4 配制SDS-PAGE凝膠23-24
• 1.7.5 加樣及電泳24
• 1.7.6 濕法轉膜24
• 1.7.7 免疫反應（目的蛋白特異性結合抗體）24-25
• 1.8 明膠酶譜技術25-28
• 1.8.1 實驗用試劑的配制25-27
• 1.8.2 樣本的收集27
• 1.8.3 加樣與電泳27-28
• 1.8.4 明膠酶譜反應28
• 1.8.5 明膠酶譜的保存28
• 1.9 統(tǒng)計學分析方法28-30
• 第二章 實驗結果30-38
• 2.1 細胞培養(yǎng)30-31
• 2.2 細胞內ROS檢測31
• 2.3 細胞核內Nrf2蛋白水平檢測31-32
• 2.4 Nrf2-ARE信號通路下游抗氧化蛋白表達檢測32-35
• 2.5 基質降解相關蛋白的檢測35-38
• 第三章 討論38-40
• 第四章 結論40-41
• 參考文獻41-43
• 綜述43-53
• 參考文獻48-53
• 攻讀學位期間的研究成果53-54
• 致謝54-55

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