本文關(guān)鍵詞：EBV-LMP2A誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞EMT和對(duì)其生物學(xué)特性的影響

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【摘要】：EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)屬于人類皰疹病毒γ家族,與鼻咽癌的發(fā)病密切相關(guān),研究證實(shí),95%以上未分化型鼻咽癌組織中都可以檢測(cè)出EB病毒感染,鼻咽癌細(xì)胞的EB病毒感染類型屬于潛伏感染Ⅱ型,即僅表達(dá)低免疫原性EB病毒核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)、潛伏膜蛋白1(Latent membrane protein-1,LMP1)和潛伏膜蛋白2(Latent membrane protein-2,LMP2)。研究發(fā)現(xiàn)EBV感染的鼻咽癌患者中有95%的患者LMP2A的m RNA水平檢測(cè)是陽(yáng)性,其中50%患者LMP2A蛋白表達(dá)水平檢測(cè)是陽(yáng)性的;然而在EBV感染的鼻咽癌患者中只有65%的患者LMP1的m RNA水平檢測(cè)是陽(yáng)性,其中35%的患者LMP1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)是陽(yáng)性的,由此可見(jiàn)無(wú)論在基因水平還是蛋白水平LMP2A的表達(dá)水平都比LMP1高。因此,EB病毒編碼LMP2A與LMP1相比,可能在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用,是鼻咽癌發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn),也是尋找鼻咽癌早期診斷、治療新方法、判斷預(yù)后的突破點(diǎn)。目的1,構(gòu)建及鑒定EB病毒編碼LMP2A基因重組慢病毒載體及在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá);2,探討LMP2A與鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系;3,探討LMP2A與鼻咽癌生物學(xué)特性的關(guān)系。研究方法:1,構(gòu)建重組慢病毒p LMP2A,采用PCR擴(kuò)增LMP2A基因,提取plv-GFP質(zhì)粒,Bam H I與Mlu I雙酶切LMP2A基因和plv-GFP質(zhì)粒,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,用LB氨芐平板培養(yǎng)過(guò)夜,得到重組慢病毒載體p LMP2A,經(jīng)PCR、重組質(zhì)粒電泳和雙酶切進(jìn)一步鑒定;2,將重組慢病毒載體p LMP2A、pdelta-8.91、p VSVG重組慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒上清液;將感染復(fù)數(shù)(MOI值)為10的重組慢病毒LV-LMP2A加入CNE1細(xì)胞培養(yǎng)板中,得到LV-LMP2A-CNE1細(xì)胞;同樣的方法得到空載轉(zhuǎn)染組LV-CNE1細(xì)胞。經(jīng)單克隆篩選后,采用RT-PCR、wetern blot、免疫熒光檢測(cè)LMP2A在人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1中的表達(dá)。3,采用wetern blot和免疫熒光檢測(cè)LV-LMP2A-CNE1細(xì)胞和LV-CNE1細(xì)胞中EMT相關(guān)分子(E-cadherin、vimentin和N-cadherin)的蛋白表達(dá);4,采用CCK8法檢測(cè)LMP2A對(duì)鼻咽癌增殖特性的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP2A對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲特性的影響;采用細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP2A對(duì)鼻咽癌細(xì)胞錨定靶向作用和非錨定靶向作用的影響,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LMP2A對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡特性的影響。結(jié)果:1,將得到的重組慢病毒載體p LMP2A,進(jìn)行內(nèi)切酶Bam HⅠ和MluⅠ雙酶切,然后進(jìn)行凝膠電泳,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒能被完全切開(kāi),在1500bp處出現(xiàn)目的基因片段;2,RT-PCR、Western blot、免疫熒光結(jié)果顯示篩選出的細(xì)胞克隆能高表達(dá)EBV-LMP2A;3,western blot和免疫熒光結(jié)果顯示LMP2A基因能夠促進(jìn)N-cadherin和vimentin的表達(dá),而抑制E-cadherin的表達(dá);4,CCK8結(jié)果顯示LMP2A能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LMP2A能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LMP2A能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的錨定靶向作用和非錨定靶向作用;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示LMP2A能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:1,成功構(gòu)建了高表達(dá)LMP2A鼻咽癌細(xì)胞株LV-LMP2A-CNE1細(xì)胞;2,LMP2A基因能夠誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT);3,LMP2A基因能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 LMP2A EMT
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 高表達(dá)EB病毒編碼LMP2A基因鼻咽癌細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定13-28
• 前言13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-28
• 第二部分 LMP2A誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和對(duì)其生物學(xué)特性的影響28-44
• 前言28
• 材料與方法28-35
• 結(jié)果35-41
• 討論41-44
• 小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄1 英文縮寫(xiě)詞表61-63
• 附錄2 在讀期間參與工作63-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 甄永蘇;;抗體藥物與腫瘤靶向治療[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2007年02期

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本文編號(hào)：841101