本文關(guān)鍵詞：EBV-LMP2A誘導(dǎo)鼻咽癌細胞EMT和對其生物學特性的影響

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【摘要】：EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)屬于人類皰疹病毒γ家族,與鼻咽癌的發(fā)病密切相關(guān),研究證實,95%以上未分化型鼻咽癌組織中都可以檢測出EB病毒感染,鼻咽癌細胞的EB病毒感染類型屬于潛伏感染Ⅱ型,即僅表達低免疫原性EB病毒核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)、潛伏膜蛋白1(Latent membrane protein-1,LMP1)和潛伏膜蛋白2(Latent membrane protein-2,LMP2)。研究發(fā)現(xiàn)EBV感染的鼻咽癌患者中有95%的患者LMP2A的m RNA水平檢測是陽性,其中50%患者LMP2A蛋白表達水平檢測是陽性的;然而在EBV感染的鼻咽癌患者中只有65%的患者LMP1的m RNA水平檢測是陽性,其中35%的患者LMP1蛋白表達水平檢測是陽性的,由此可見無論在基因水平還是蛋白水平LMP2A的表達水平都比LMP1高。因此,EB病毒編碼LMP2A與LMP1相比,可能在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用,是鼻咽癌發(fā)病機制研究的重點,也是尋找鼻咽癌早期診斷、治療新方法、判斷預(yù)后的突破點。目的1,構(gòu)建及鑒定EB病毒編碼LMP2A基因重組慢病毒載體及在鼻咽癌細胞中的表達;2,探討LMP2A與鼻咽癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系;3,探討LMP2A與鼻咽癌生物學特性的關(guān)系。研究方法:1,構(gòu)建重組慢病毒p LMP2A,采用PCR擴增LMP2A基因,提取plv-GFP質(zhì)粒,Bam H I與Mlu I雙酶切LMP2A基因和plv-GFP質(zhì)粒,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后進行連接、轉(zhuǎn)化,用LB氨芐平板培養(yǎng)過夜,得到重組慢病毒載體p LMP2A,經(jīng)PCR、重組質(zhì)粒電泳和雙酶切進一步鑒定;2,將重組慢病毒載體p LMP2A、pdelta-8.91、p VSVG重組慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒上清液;將感染復(fù)數(shù)(MOI值)為10的重組慢病毒LV-LMP2A加入CNE1細胞培養(yǎng)板中,得到LV-LMP2A-CNE1細胞;同樣的方法得到空載轉(zhuǎn)染組LV-CNE1細胞。經(jīng)單克隆篩選后,采用RT-PCR、wetern blot、免疫熒光檢測LMP2A在人鼻咽癌細胞株CNE1中的表達。3,采用wetern blot和免疫熒光檢測LV-LMP2A-CNE1細胞和LV-CNE1細胞中EMT相關(guān)分子(E-cadherin、vimentin和N-cadherin)的蛋白表達;4,采用CCK8法檢測LMP2A對鼻咽癌增殖特性的影響;采用劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗檢測LMP2A對鼻咽癌細胞遷移和侵襲特性的影響;采用細胞平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測LMP2A對鼻咽癌細胞錨定靶向作用和非錨定靶向作用的影響,采用流式細胞儀檢測LMP2A對鼻咽癌細胞凋亡特性的影響。結(jié)果:1,將得到的重組慢病毒載體p LMP2A,進行內(nèi)切酶Bam HⅠ和MluⅠ雙酶切,然后進行凝膠電泳,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒能被完全切開,在1500bp處出現(xiàn)目的基因片段;2,RT-PCR、Western blot、免疫熒光結(jié)果顯示篩選出的細胞克隆能高表達EBV-LMP2A;3,western blot和免疫熒光結(jié)果顯示LMP2A基因能夠促進N-cadherin和vimentin的表達,而抑制E-cadherin的表達;4,CCK8結(jié)果顯示LMP2A能夠促進鼻咽癌細胞增殖;劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示LMP2A能夠促進鼻咽癌細胞遷移和侵襲;細胞克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果顯示LMP2A能夠增強鼻咽癌細胞的錨定靶向作用和非錨定靶向作用;流式細胞儀結(jié)果顯示LMP2A能夠抑制鼻咽癌細胞的凋亡。結(jié)論:1,成功構(gòu)建了高表達LMP2A鼻咽癌細胞株LV-LMP2A-CNE1細胞;2,LMP2A基因能夠誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT);3,LMP2A基因能夠促進鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 LMP2A EMT
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 高表達EB病毒編碼LMP2A基因鼻咽癌細胞株的構(gòu)建及鑒定13-28
• 前言13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-28
• 第二部分 LMP2A誘導(dǎo)鼻咽癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和對其生物學特性的影響28-44
• 前言28
• 材料與方法28-35
• 結(jié)果35-41
• 討論41-44
• 小結(jié)44-45
• 參考文獻45-49
• 文獻綜述49-61
• 參考文獻55-61
• 附錄1 英文縮寫詞表61-63
• 附錄2 在讀期間參與工作63-64
• 致謝64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 甄永蘇;;抗體藥物與腫瘤靶向治療[J];醫(yī)學研究雜志;2007年02期

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本文編號：841101