本文關(guān)鍵詞：MiR-145通過靶向作用于Smad3抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力

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【摘要】：背景與目的的:鼻咽癌是頭頸外科腫瘤中常見的癌癥,具有高度的轉(zhuǎn)移能力,在亞洲地區(qū)較為流行,特別是在中國南方。隨著表觀遺傳學的不斷發(fā)展,近年來mi RNA在多種腫瘤中的各種生物學作用越來越受到科研工作者的重視。mi R-145被報道在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤的作用,并且已有報道m(xù)i R-145在鼻咽癌組織中明顯低表達,但其功能仍未有報道。本研究旨在驗證mi R-145在鼻咽癌組織標本及鼻咽癌細胞中的表達情況,通過探討鼻咽癌中mi R-145的生物學功能及其可能的調(diào)控機制,為鼻咽癌的診斷和治療提供確鑿的實驗依據(jù)和新的方向。方法:(1)采用Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測在人永生化的鼻咽部上皮細胞NP69和3株鼻咽癌細胞(CNE-1、CNE-2和CNE-2Z)以及11對鼻咽癌組織樣本中mi R-145的表達水平。(2)將mi R-145的模擬體mi R-145 mimics(mi R-NC)和抑制劑mi R-145 inhibitor(mi R-NC inhibitor)轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細胞株(CNE-2和CNE-2Z)中,通過CCK-8實驗觀察細胞的增殖情況,以及Transwell實驗了解其對細胞遷移、侵襲的影響。(3)生物信息學軟件Target Scan、Pic Tar和mi Randa對mi R-145的靶基因進行預測,初步篩選出目的基因Smad3。運用雙熒光素酶活性檢測實驗驗證相關(guān)mi R-145是否與Smad33’UTR區(qū)域的種子序列直接靶向結(jié)合,驗證靶基因。在鼻咽癌細胞株中過表達和抑制表達mi R-145后檢測Smad3 m RNA和蛋白表達水平。(4)將si-Smad3(si-NC)轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細胞中,使用Western Blot技術(shù)檢測Smad3的蛋白表達情況,以確保干擾Smad3的效果,通過CCK-8方法觀察細胞的增殖情況,及應用Transwell試驗了解其對細胞遷移、侵襲的影響。(5)q RT-PCR方法檢測在人永生化的鼻咽部上皮細胞NP69和3株鼻咽癌細胞以及11對鼻咽癌組織樣本中Smad3的表達情況,并將其和mi R-145的表達作回歸分析,統(tǒng)計出鼻咽癌中mi R-145和Smad3表達的相關(guān)性。結(jié)果:(1)與NP69相比,mi R-145在鼻咽癌細胞株CNE-1、CNE-2和CNE-2Z的表達均是明顯下調(diào)的;同樣,與11例鼻咽部非腫瘤組織相比,11例鼻咽癌組織樣本中mi R-145表達下調(diào)。綜上所述,mi R-145在鼻咽癌中低表達。(2)在轉(zhuǎn)染mi R-145mimics后CNE-2和CNE-2Z細胞株細胞增殖明顯減慢,細胞的遷移及侵襲能力顯著下降。而在轉(zhuǎn)染mi R-145 inhibitor后,呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。(3)生物信息學軟件預測分析出可能與mi R-145特異結(jié)合的靶基因的3’UTR區(qū),通過瞬時轉(zhuǎn)染mi R-145 mimics(mi R-NC)和mi R-145 inhibitor(mi R-NC inhibitor)檢測靶基因在m RNA和蛋白水平的表達改變情況以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C,最后得出Smad3作為mi R-145的目的基因成為本次研究的靶基因。(4)將si-Smad3轉(zhuǎn)染到CNE-2和CNE-2Z細胞株后,我們發(fā)現(xiàn)Smad3的蛋白表達水平明顯下降,表明si-Smad3成功地干擾了Smad3的表達,生物學功能實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-Smad3后細胞增殖未見明顯變化,細胞的遷移及侵襲能力下降。表明鼻咽癌中Smad3可能主要發(fā)揮促進鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用。(5)與NP69相比,在鼻咽癌細胞株CNE-1、CNE-2和CNE-2Z中Smad3的表達明顯上調(diào);在11例鼻咽癌組織樣本中檢測得到Smad3的表達與11例鼻咽部非腫瘤組織相比也是上調(diào)的。也就是說,在鼻咽癌中Smad3是高表達的。將其和mi R-145的表達作回歸分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中兩者的表達之間是呈負相關(guān)。結(jié)論:本實驗表明mi R-145在人鼻咽癌中呈現(xiàn)低表達水平,通過發(fā)揮抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力,進而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。利用生物信息學和雙熒光實驗等方法發(fā)現(xiàn)并驗證mi R-145的直接靶基因Smad3。干擾Smad3后鼻咽癌的遷移和侵襲能力明顯受到了抑制,與mi R-145作用結(jié)果相一致;Smad3在鼻咽癌組織和細胞中高表達,與mi R-145之間呈現(xiàn)負相關(guān),進一步證實了mi R-145可以通過特異性結(jié)合Smad3的3’UTR區(qū)發(fā)揮抑制鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。為進一步深入研究鼻咽癌的發(fā)病機制及診斷治療鼻咽癌提供了科學的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：詞詞::鼻咽癌 miR-145 Smad3 侵襲
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-17
• 參考文獻14-17
• 第一部分 mi R-145在鼻咽癌中的表達及對細胞增殖、遷移和侵襲的影響17-32
• 引言17-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-32
• 第二部分 mi R-145靶基因的預測及驗證，靶基因功能的研究及兩者之間的關(guān)系32-52
• 引言32-33
• 材料與方法33-45
• 結(jié)果45-52
• 全文總結(jié)52-54
• 全文討論54-57
• 參考文獻57-61
• 綜述 頭頸腫瘤中mi RNA研究進展61-67
• 參考文獻64-67
• 縮略詞表67-68
• 攻讀碩士學位發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-70

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本文編號：814419