發(fā)布時(shí)間：2017-07-20 08:33

  本文關(guān)鍵詞：TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景角膜移植是機(jī)體內(nèi)移植成功率最高的器官移植之一,而移植后排斥反應(yīng)是導(dǎo)致角膜移植失敗的最主要原因。研究認(rèn)為：角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)是一個(gè)多成分參與、極為復(fù)雜和精細(xì)調(diào)節(jié)的反應(yīng)過(guò)程。移植后隨著移植抗原的提呈,CD4+T細(xì)胞激活,促使Th1分化,分泌IL-2. IFN-y、TNF-a等細(xì)胞因子,因此所致的遲發(fā)型超敏反應(yīng)在角膜移植中起主導(dǎo)作用。Kuffova等認(rèn)為移植后的免疫反應(yīng)早期表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)。Holland等也觀察到在角膜排斥的早期存在非特異性的炎癥反應(yīng)：T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集在切口和縫線的周圍,角膜植片增厚。Holland強(qiáng)調(diào)排斥反應(yīng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)不同于同基因移植術(shù)后的細(xì)胞免疫,術(shù)后早期切口和縫線周圍的非特異性炎癥是誘導(dǎo)供體內(nèi)皮細(xì)胞損傷、新生血管生長(zhǎng)的重要因素。在炎癥性植床,供體來(lái)源地樹(shù)突狀細(xì)胞移行到宿主的頸部淋巴結(jié)激活宿主T細(xì)胞,通過(guò)直接途徑誘發(fā)排斥反應(yīng)。角膜移植急性排斥反應(yīng)的病理變化具有兩個(gè)主要特征：角膜基質(zhì)層的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管。角膜基質(zhì)以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主,尚可見(jiàn)漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞等。炎癥的后果,導(dǎo)致角膜作為免疫特赦區(qū)域的優(yōu)勢(shì)完全消失,排斥反應(yīng)發(fā)生早且嚴(yán)重,免疫抑制劑也發(fā)揮不了調(diào)控作用。雖然排斥反應(yīng)是由宿主機(jī)體通過(guò)抗原提呈細(xì)胞激活CD4+T細(xì)胞促使,但最新證據(jù)表明先天免疫系統(tǒng)在其中也起著重要作用。TLRs (Toll like receptors)被譽(yù)為連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁,而Toll樣受體2(TLR2)是目前已克隆人類TLRs家族中表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子。它分布于抗原提呈細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、多種組織細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等,在細(xì)菌、真菌、病毒及其他一些病原體感染中發(fā)揮先天性免疫作用,并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程連接獲得性免疫。目前為止,發(fā)現(xiàn)的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少有兩條,根據(jù)接頭蛋白的不同,可將其分為MyD88依賴性和非MyD88依賴性兩條途徑,TLR2主要以MyD88依賴性途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)TLR2單克隆抗體可以通過(guò)阻斷TLR2-Myd88-NF-KB和TLR2-Myd88-IRF3路徑,減輕移植后急性排斥反應(yīng),延長(zhǎng)心臟移植物的存活時(shí)間。另有學(xué)者認(rèn)為,MyD88缺陷小鼠可誘導(dǎo)供體抗原特異性的腎移植免疫耐受,以此逃避急性和慢性排斥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用抗CD40L抗體后,無(wú)論是MyD88缺陷的供體還是受體都可減少移植后炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些研究都說(shuō)明：TLR2可能通過(guò)MyD88下傳信號(hào),參與了同種異體器官移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)。我們的前期研究也已證實(shí)：TLR2可能參與了大鼠角膜移植排斥反應(yīng),在同種異體移植組術(shù)后第9天檢測(cè)到TLR2mRNA的表達(dá)特異性增高,與組織病理學(xué)結(jié)果相吻合,免疫熒光結(jié)果顯示TLR2在角膜移植術(shù)后第9天表達(dá)特異性增高并伴細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論我們通過(guò)運(yùn)用TLR2單克隆抗體阻斷TLR2的表達(dá),觀察移植術(shù)后植片的存活情況,臨床觀察術(shù)后第9-15d植片的排斥情況并行HE染色觀察,并于術(shù)后第9d行免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2及其下游信號(hào)分子MyD88的表達(dá)及分布情況,以進(jìn)一步證實(shí)TLR2及其下游信號(hào)分子MyD88在角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)中的重要作用。對(duì)TLR2/MyD88信號(hào)通路的深入了解不僅有助于我們明確TLR2在角膜移植排斥反應(yīng)中的作用及其分子基礎(chǔ),為臨床防治角膜移植排斥提供理論基礎(chǔ),也有利于某些疾病如腫瘤、微生物感染、過(guò)敏和自身免疫性疾病等免疫反應(yīng)機(jī)理的探索,為今后在相應(yīng)疾病的治療和疫苗研制等方面的研究提供新切入點(diǎn),為臨床治療這些疾病開(kāi)辟更為廣闊的路徑。第一部分TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植術(shù)后植片存活情況的實(shí)驗(yàn)研究目的觀察TLR2單克隆抗體對(duì)同種異體大鼠角膜移植術(shù)后植片的存活情況的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為三組：正常對(duì)照組(N)、同種異體角膜移植組(A)和同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組(mAb), A、mAb兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠分別行穿透性角膜移植術(shù),同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體組經(jīng)球結(jié)膜下注射給予15ug的TLR2單克隆抗體,自手術(shù)當(dāng)日起隔天給藥,即術(shù)后第0、2、4、6、8d,共5次；同種異體移植組術(shù)后以同法予等量的生理鹽水。術(shù)后每日裂隙燈下觀察角膜的水腫、透明度、新生血管生長(zhǎng)情況,并對(duì)植片進(jìn)行排斥反應(yīng)指數(shù)評(píng)分,由2人分別計(jì)數(shù)取平均值,記錄各組大鼠角膜植片發(fā)生排斥反應(yīng)的平均天數(shù)。分別于術(shù)后第9d、15d取各組大鼠眼球石蠟包埋行HE染色后電子顯微鏡下觀察各層角膜組織的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果術(shù)后各組角膜隨時(shí)間的變化均表現(xiàn)出不同程度的水腫、混濁及新生血管生成,以同種異體角膜移植組為甚。同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體組發(fā)生排斥反應(yīng)的時(shí)間為(15.67±0.753)d,較同種異體角膜移植組(9.67±0.876)d明顯延遲,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.001)。HE染色結(jié)果顯示：正常角膜組織分5層,各層結(jié)構(gòu)清晰,基質(zhì)層膠原疏松、排列整齊,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第9d,同種異體角膜移植組角膜植片厚度增加,基質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂,新生血管管腔散在分布,并伴有多量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；TLR2單克隆抗體組角膜各層結(jié)構(gòu)尚清晰,基質(zhì)層中僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第15d,同種異體角膜移植組角膜增厚明顯,角膜全層結(jié)構(gòu)不清晰,其間可見(jiàn)多量的新生血管管腔和大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而在TLR2單克隆抗體組,角膜各層結(jié)構(gòu)尚清晰,基質(zhì)層中僅可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論TLR2單克隆抗體能有效地延長(zhǎng)大鼠同種異體角膜移植術(shù)后植片的存活時(shí)間,減輕移植術(shù)后炎癥反應(yīng)。第二部分TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng)在大鼠角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)中的作用探討目的探討TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng)在大鼠角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為四組,包括正常對(duì)照組、自體角膜移植組、同種異體角膜移植組和同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組,三個(gè)手術(shù)組大鼠均行穿透性角膜移植術(shù),術(shù)后同種異體角膜移植TLR2單克隆抗體給藥組經(jīng)球結(jié)膜下注射予15ug的TLR2單克隆抗體,自術(shù)后當(dāng)日起隔天給藥,即術(shù)后第0、2、4、6、8d,共5次；自體組與同種異體移植組以同法給予等量的生理鹽水。術(shù)后每日裂隙燈下觀察角膜的水腫、透明度和新生血管生長(zhǎng)情況,并對(duì)植片進(jìn)行排斥反應(yīng)指數(shù)評(píng)分,由2人分別計(jì)數(shù)取平均值。術(shù)后第9d取各組大鼠眼球石蠟包埋后行HE及免疫組化染色,另取各組大鼠角膜組織行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)角膜組織中TLR2mRNA、MyD88mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果術(shù)后隨時(shí)間變化各組角膜植片均表現(xiàn)出不同程度的腫脹、渾濁及新生血管生成,特別是在同種異體角膜移植組中。HE染色結(jié)果顯示：正常角膜組織分5層,各層結(jié)構(gòu)清晰,基質(zhì)層膠原疏松、排列整齊,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第9d,自體組角膜各層結(jié)構(gòu)清楚,僅基質(zhì)層中見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),余未見(jiàn)明顯異常；TLR2單克隆抗體組角膜各層結(jié)構(gòu)尚清晰,基質(zhì)層中僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而在同種異體組,角膜植片各層結(jié)構(gòu)明顯增厚,基質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清,其間可見(jiàn)新生血管管腔,伴多量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：TLR2和MyD88分子在正常對(duì)照組、自體組及TLR2單克隆抗體組的角膜上皮中均有微量表達(dá),而同種異體組角膜上皮、基質(zhì)細(xì)胞中TLR2和MyD88分子的表達(dá)明顯增多,尤以基質(zhì)層明顯。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：在正常對(duì)照組(1.01±0.213,1.00±0.07)、自體移植組(3.40±1.007,2.42±0.479)、同種異體移植組(23.7±1.974,4.11±0.572)和TLR2單克隆抗體組(12.87±2.001,2.32±0.758)中都檢測(cè)到TLR2mRNA和MyD88mRNA的表達(dá)；同種異體組TLR2mRNA、 MyD88 mRNA表達(dá)程度較正常對(duì)照組和自體組明顯上升,而在TLR2單克隆抗體組(mAb組)中二者表達(dá)較異體組明顯降低,且趨勢(shì)一致;將各組TLR2mRNA、 MyD88mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)TLR2: p=0.081,方差齊；MyD88:p=0.145,方差齊。然后選用LSD法兩兩之間進(jìn)行比較,MyD88RNA在三個(gè)手術(shù)干預(yù)組中的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著升高(P=0.012,0.016,0.000),在TLR2單克隆抗體組中的表達(dá)也明顯低于同種異體角膜移植組(P=0.003),TLR2mRNA除了在正常對(duì)照組與自體組之間無(wú)顯著差異(P=0.098)外,正常對(duì)照組、TLR2單克隆抗體組及同種異體組之間的組間比較都有明顯差異,且其表達(dá)趨勢(shì)與MyD88基本一致。結(jié)論TLR2單克隆抗體抑制TLR2及其下游信號(hào)分子MyD88的表達(dá)；TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng)參與了角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng),影響了角膜植片的轉(zhuǎn)歸。
【關(guān)鍵詞】：角膜移植 TLR2 單克隆抗體 存活時(shí)間 TLR2單克隆抗體 TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng) 角膜移植 免疫排斥
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R779.6
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-28
• 1 角膜移植排斥反應(yīng)的研究現(xiàn)狀17-18
• 2 TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng)的生物學(xué)特性18-20
• 3 TLR2/MyD88信號(hào)系統(tǒng)在移植免疫排斥中的研究進(jìn)展20-22
• 4 立題依據(jù)及意義22-23
• 參考文獻(xiàn)23-28
• 第一部分 TLR2單克隆抗體影響大鼠角膜移植術(shù)后植片存活情況的實(shí)驗(yàn)研究28-43
• 1.1 材料29-30
• 1.2 方法30-32
• 1.3 結(jié)果32-36
• 1.4 討論36-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 第二部分 TLR2/MYD88信號(hào)系統(tǒng)在大鼠角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)中的作用探討43-64
• 2.1 材料44-45
• 2.2 方法45-51
• 2.3 結(jié)果51-57
• 2.4 討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 全文小結(jié)64-66
• 縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表66-67
• 研究成果67-68
• 致謝68-70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 白浪;陸曉和;鐘彥彥;張靜;周瑾;武海軍;;糖皮質(zhì)激素對(duì)角膜移植術(shù)后大鼠角膜TLR2表達(dá)的影響[J];眼科研究;2009年11期

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本文編號(hào)：567137