本文關(guān)鍵詞：豚鼠血迷路屏障對(duì)PPTA的通透性以及PPTA對(duì)豚鼠突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾保護(hù)機(jī)制研究

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【摘要】：De Kleyn在1944年提出了突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾的概念,并將其定義為至少超過(guò)3天連續(xù)3個(gè)頻率聽(tīng)力下降至少30dB。感音神經(jīng)性耳聾可以通過(guò)病史及聽(tīng)力檢查等來(lái)確定。聽(tīng)力減退是一種非常常見(jiàn)的疾病,不同的大型調(diào)查得出的數(shù)據(jù)有所出入,De Kleyn認(rèn)為其發(fā)病率大約在0.05‰至0.2‰。全球性的調(diào)查發(fā)現(xiàn)突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生率在每年0.03%。但是德國(guó)的調(diào)查認(rèn)為該病發(fā)病率為1.6‰。血管因素是目前突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制假說(shuō),以前學(xué)者們都在研究耳蝸缺血所導(dǎo)致的突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾,目前正在轉(zhuǎn)向研究耳蝸的缺血-再灌注損傷。缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型制作方法較多,使用較為多的是Kuaskari的經(jīng)聽(tīng)泡途徑直接壓迫迷路動(dòng)脈制作缺血再灌注模型及通過(guò)開(kāi)顱或頸部切口壓迫椎動(dòng)脈制作缺血再灌注模型。但是這些方法都有其明顯的劣勢(shì),本文使用的是頸頸部正中切口分離出雙側(cè)椎動(dòng)脈及一側(cè)頸總動(dòng)脈,夾畢1h來(lái)制作缺血模型,同時(shí)松開(kāi)以制作再灌注模型。此方法較為簡(jiǎn)單,便于觀察,術(shù)后豚鼠存活率較高。目前臨床上治療突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾主要是通過(guò)靜脈或局部給予糖皮質(zhì)激素及擴(kuò)血管溶栓等治療為主,對(duì)缺血再灌注給內(nèi)耳帶來(lái)的的損害作用欠佳,如何阻止缺血再灌注對(duì)于內(nèi)耳組織的損害成為治療缺血性內(nèi)耳疾病的關(guān)鍵問(wèn)題。鹽酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,PPTA)是由廣州市眾為生物技術(shù)有限公司和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合作自主研制的鈣增敏劑類(lèi)強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑, 為首次合成的全新化合物,其藥物物質(zhì)及其合成工藝等3個(gè)相關(guān)專(zhuān)利己獲授權(quán),屬1.1類(lèi)化學(xué)藥。大量研究表明鹽酸椒苯酮胺對(duì)腦、心臟、耳蝸的缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用。并在已完成126例中國(guó)健康受試者的I期臨床試驗(yàn)中顯示了良好的耐受性,目前正準(zhǔn)備做第1I期臨床試驗(yàn)。目前,鹽酸椒苯酮胺能否通過(guò)血迷路屏障以及不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)注射PPTA對(duì)于突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾的保護(hù)作用是否不同仍不清楚。本文研究主要目的為探知鹽酸椒苯酮胺對(duì)于豚鼠耳蝸血迷路屏障的通過(guò)性及鹽酸椒苯酮胺對(duì)于豚鼠突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾中IL-1 p及TNF-amRNA表達(dá)的影響,主要分一下兩部分。第一部分超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析耳蝸外淋巴液中鹽酸椒苯酮胺摘要：突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾是影響公眾身體健康和生活質(zhì)量的重要因素,由缺血再灌注損傷導(dǎo)致的感音神經(jīng)性耳聾是耳聾發(fā)病的重要因素之一,鹽酸椒苯酮胺能夠改善缺血再灌注損傷所致的感音神經(jīng)性耳聾。本文首次通過(guò)超高效液相色譜／質(zhì)譜測(cè)定建立一快速、準(zhǔn)確、高效靈敏的耳蝸內(nèi)淋巴液中鹽酸椒苯酮胺分析方法。經(jīng)O asis(?)MCX (30um)固相提取法富集凈化,以Waters-ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 um,2.1mm i.d.×50mm)色譜柱分離,乙腈-水位流動(dòng)相梯度洗脫,在4min中內(nèi)可完成分離檢測(cè)。豚鼠耳蝸外淋巴液鹽酸椒苯酮胺濃度在1.2-480ng內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r0.99。分低、中、高三個(gè)水平,鹽酸椒苯酮胺的回收率分別為81.4%、85.3%、89.6%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.3%、7.2%、4.1%。日內(nèi)、日間RSD均10%,穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD10%。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng),適用于豚鼠耳蝸外淋巴液鹽酸椒苯酮胺濃度檢測(cè)。第二部分鹽酸椒苯酮胺對(duì)突發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾IL-1p和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響探討鹽酸椒苯酮胺對(duì)缺血再灌注損傷所致的突發(fā)感音神經(jīng)性耳聾的耳蝸組織的保護(hù)作用機(jī)制。通過(guò)夾畢雙側(cè)椎動(dòng)脈及一側(cè)頸總動(dòng)脈制作缺血再灌注模型,54只豚鼠隨機(jī)分成九組,正常組、I/R 1d組、2.5mg/Kg PPTA(ST)組,5mg/Kg PPTA (ST)組,10mg/Kg PPTA (ST)組,I/R 3d組、2.5mg/Kg PPTA(3d)組,5mg/Kg PPTA (3d)組,10mg/Kg PPTA (3d)組,每組6只。缺血再灌注成功后,立即給予PPTA (ST)組豚鼠股靜脈注射術(shù)前配置好的PPTA,劑量分別為2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg。缺血再灌注成功后48h,分別給PPTA(3d)注射PPTA,劑量分別為2.5mg/kg、5mg/kg及10mg/kg。缺血再灌注組注射等量生理鹽水,正常組不做處理,24h后測(cè)ABR,斷頭,取右耳耳蝸,用RT-PCR法檢測(cè)IL-1β和TNF-a的mRNA表達(dá)量。用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA, P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PPTA用藥組的ABR RT閾移較缺血再灌注組明顯降低,且閾移值與PPTA用藥量成反比。熒光定量PCR產(chǎn)物溶解曲線分析顯β-actin、IL-1β、TNF-α三個(gè)基因的溶解曲線均呈現(xiàn)單峰,表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。以β-actin為內(nèi)參,用2-△△cT法進(jìn)行相對(duì)定量,表明與正常組相比各組IL-1βmRNA表達(dá)量明顯升高(均P0.01),與正常組相比各組間TNF-a的mRNA表達(dá)量均明顯升高(均P0.01)。與I/R 1天組相比,PPTA (ST)各劑量組的IL-1βmRNA的表達(dá)量明顯降低(均P0.01)。且隨著用藥劑量的增大,IL-1βmRNA的表達(dá)量逐漸降低(均P0.001)。與I/R 3d組相比,PPTA (3d)各劑量組的IL-1p的mRNA表達(dá)量均降低(均P0.01)。25mg/Kg PPTA(3d)組和5mg/Kg PPTA (3d)組IL-1p的mRNA表達(dá)量間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,10mg/Kg PPTA (3d)組IL-1pmRNA的表達(dá)量明顯低于5mg/Kg PPTA (3d)組(均P0.05)。與I/R 1天組相比,PPTA(ST)各劑量組的TNF-αmRNA的表達(dá)量明顯降低(均P0.01)。且隨著用藥劑量的增大,TNF-αmRNA的表達(dá)量逐漸降低(均P0.01)。與I/R 3d相比,PPTA(3d)各劑量組的TNF-αmRNA表達(dá)量均降低(均P0.001),2.5mg/Kg PPTA (3d)組TNF-αmRNA的表達(dá)量明顯高于其余兩組(均P0.05)。5 mg/Kg PPTA (3d)組TNF-αmRNA的表達(dá)量明和10 mg/KgPPTA (3 d)組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述,PPTA具有降低耳蝸組織IL-1p和TNF-αmRNA的表達(dá)而拮抗缺血再灌注損傷及保護(hù)聽(tīng)力。
【關(guān)鍵詞】：超高效液相色譜 鹽酸椒苯酮胺 固相萃取 耳蝸外淋巴液 耳蝸 缺血再灌注損傷 鹽酸椒苯酮胺 IL-1β TNF-α
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R764.43
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-12
• 第一部分 超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析耳蝸外淋巴液中鹽酸椒苯酮胺12-27
• 1.1 前言12-14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)部分14-18
• 1.3 結(jié)果與討論18-24
• 1.4 結(jié)論24-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第二部分 PPTA對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響27-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 2.3 結(jié)果35-39
• 2.4 討論39-49
• 2.5 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 全文結(jié)論56-57
• 縮略詞表57-58
• 綜述58-71
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 碩士在讀期間的論文發(fā)表71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 賓娟;王茜;徐江平;;椒苯酮胺對(duì)全腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2012年03期

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本文編號(hào)：520821