本文關鍵詞：非基因重編程及生物模擬誘導促進ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細胞球注射移植的影響目的:3D球形培養(yǎng)和ROCK抑制劑對提高細胞活力,促進細胞增殖有很好的作用,本研究的目的是探索ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細胞(B-CECs)在體外的生長,可注射移植,以及球形3D培養(yǎng)的影響。方法:采用胰酶消化法從屠宰場獲得的牛眼球中分離得到原代角膜內(nèi)皮細胞(B-CEC),采用多細胞微球具模型進行B-CEC的球形培養(yǎng)并利用細胞死活染色、Ed U染色和CCK-8檢測評估ROCK抑制劑對B-CEC球與B-CECs增殖和活性的影響。利用體外可注射移植實驗分析ROCK抑制劑對B-CEC球在細胞培養(yǎng)板和仿生脫細胞角膜貼壁能力的影響,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。結果:免疫熒光染色表明Y-23672不改變CECs的表型,但通過細胞死活染色實驗、Ed U染色實驗和CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)Y-23672可以顯著提高B-CECs與B-CEC球細胞的活性和增殖。采用多細胞微球具模型形成大小均勻的B-CEC球比單散CECs有更高分化潛能。體外模擬移植可注射性實驗顯示,經(jīng)Y-23672處理的成球一天移植到細胞板或脫細胞角膜貼壁5天的B-CEC球可以貼壁完全并成鋪路石樣的單層細胞,而無Y-23672處理的對照組B-CEC球接種后仍有細胞聚集。結論:與2D培養(yǎng)相比較,3D培養(yǎng)法能使B-CEC球有更高的分化潛能;ROCK抑制劑可以提升球形培養(yǎng)B-CEC的活力,促進球形培養(yǎng)的B-CEC的增殖、遷移,且不改變B-CEC固有的基因和蛋白的表達;我們的研究結果表明3D瓊脂糖球形培養(yǎng)法結合ROCK抑制劑是形成含有角膜內(nèi)皮前體細胞和體外模擬移植可注射性B-CEC球?qū)槲磥鞢EC的治療有重要的應用意義。第二部分非基因重編程及生物模擬誘導促進ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞目的:探索重組蛋白和小分子在模擬微重力條件下對促進脂肪干細胞(ADSC)重編程成為角膜內(nèi)皮(CEC)樣細胞的影響,目標是要了解重組蛋白質(zhì),小分子和仿生環(huán)境的組合能否為促進脂肪干細胞轉分化成為角膜內(nèi)皮樣細胞建立起非基因直接重編程平臺系統(tǒng)。方法:使用膠原酶消化法分離原代ADSC,并對細胞進行表型的鑒定。利用帶有穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重編程化合物)在模擬微重力反應器(SMG)中進行ADSC的重編程誘導。重編程后的ADSC在插入式共培養(yǎng)系統(tǒng)與絲裂霉素C處理的CEC以及角膜緣基質(zhì)細胞共培養(yǎng)并接種到脫細胞牛角膜基質(zhì)進一步培養(yǎng),RT-PCR和免疫熒光鑒定直接重編程后細胞的基因、蛋白表達情況。結果:通過流式細胞術,成脂成骨分化法鑒定ADSC。使用帶穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重編程化合物)在模擬微重力反應器(SMG)中誘導后,RT-PCR和免疫熒光分析表明ADSCs陽性表達Nanog和CD34。共培養(yǎng)后的ADSC接種到脫細胞角膜上成熟后,細胞形態(tài)由紡錘樣變?yōu)槎嘟切?免疫熒光顯示直接重編程后的ADSCs弱陽性表達CD31、AQP-1、ZO-1。結論:ADSC經(jīng)過重組蛋白與小分子在模擬微重力條件下重編程誘導后,具有更高的分化潛能;與CEC以及角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)分化后接種到脫細胞角膜上呈現(xiàn)鋪路石樣六角形細胞形態(tài),且陽性表達角膜內(nèi)皮標志物CD31、AQP-1、ZO-1。這些發(fā)現(xiàn)初步實現(xiàn)了ADSC直接重編程為CEC。我們的研究也首次表明SMG旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以用作非基因手段促進直接重編程。非基因重編程為特異性多能干細胞的可塑性研究和未來自體CEC替代療法提供了新的選擇,從而避免了使用多能干細胞療法引起的并發(fā)癥的發(fā)生。
【關鍵詞】：角膜內(nèi)皮細胞 ROCK抑制劑 仿生脫細胞角膜 脂肪來源干細胞 直接重編程 角膜內(nèi)皮細胞
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R77;Q813
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-16
• 1 間充質(zhì)干細胞9
• 2 脂肪干細胞9-10
• 3 角膜內(nèi)皮細胞10-11
• 4 三維微重力旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）及應用11-12
• 5 非基因重編程和轉分化12-13
• 6 細胞球形培養(yǎng)13-16
• 本實驗研究目的、意義及內(nèi)容16-24
• 參考文獻17-24
• 第一部分Y-27632對牛角膜內(nèi)皮細胞球可注射移植的影響研究引言24-44
• 引言24
• 材料與方法24-31
• 結果31-34
• 討論34-36
• 附圖36-41
• 參考文獻41-44
• 第二部分 非基因重編程及生物模擬誘導促進人脂肪干細胞直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞引言44-70
• 引言44
• 材料與方法44-55
• 結果55-57
• 討論57-60
• 附圖60-66
• 參考文獻66-70
• 全文結論70-71
• 英文詞匯縮略注釋71-72
• 在校期間發(fā)表文章及科研成果72-73
• 致謝73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：非基因重編程及生物模擬誘導促進ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：452483