本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化基因的篩選及定位，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景鼻咽癌是我國南方地區(qū)最高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤,其原發(fā)部位隱蔽,不易被早期發(fā)現(xiàn),惡性程度高。放療是鼻咽癌治療主要的手段,盡管隨著放療技術(shù)的不斷進(jìn)步,鼻咽癌的治愈率較過去幾十年明顯提高,但是由于大部分鼻咽癌患者就診時(shí)往往已伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,甚至全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這成為能否成功治療腫瘤的最大障礙。鼻咽癌早期發(fā)生組織浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確,現(xiàn)代國內(nèi)外學(xué)者已認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因、多階段參與的復(fù)雜過程,并已開展許多基因?qū)W研究,旨在探索鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制,并試圖尋找腫瘤防治的突破口。近年來大量表觀遺傳學(xué)研究已證實(shí)基因甲基化與腫瘤相關(guān),越來越多的甲基化基因被發(fā)現(xiàn)不僅在鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用,也在發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用,但是逐個(gè)基因甲基化改變的研究難以反映鼻咽癌表觀遺傳學(xué)的宏觀改變。高通量全基因組甲基化芯片和表達(dá)譜芯片技術(shù)為多基因?qū)W研究提供了重要的技術(shù)支持,本課題擬應(yīng)用以上兩種技術(shù)聯(lián)合篩選鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,建立鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因甲基化譜,尋找鼻咽癌理想的基因標(biāo)志物,從而為鼻咽癌的基因治療提供新的靶位點(diǎn)。第一章鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因甲基化譜的初步構(gòu)建目的本研究應(yīng)用NimbleGem人類全基因組甲基化芯片技術(shù),篩選鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的異常甲基化基因,構(gòu)建鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因甲基化譜,為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。方法收集I期鼻咽癌(T1NOM0)石蠟標(biāo)本和有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌新鮮組織標(biāo)本(TxN1-3M0)各4例,分別提取樣品DNA并質(zhì)檢合格,使用超聲打斷基因組后進(jìn)行甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP),并擴(kuò)增及純化MeDIP,然后對樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記,標(biāo)記后的樣品與甲基化芯片雜交,采用高解析度芯片掃描儀檢測芯片雜交信號,采用商用分析軟件對雜交結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)提取、標(biāo)準(zhǔn)化、峰值分析、報(bào)告。結(jié)果樣品DNA質(zhì)控均合格,包括提取的總DNA、超聲破碎后DNA、免疫共沉淀甲基化DNA和熒光標(biāo)記后DNA�；蚣谆酒Y(jié)果發(fā)現(xiàn),4例I期鼻咽癌標(biāo)本中有1134個(gè)基因均發(fā)生甲基化,而4例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌標(biāo)本中均發(fā)生甲基化的基因數(shù)目是835個(gè)；兩組鼻咽癌標(biāo)本中均發(fā)生甲基化的基因?yàn)?96個(gè)。與4例I期鼻咽癌標(biāo)本相比,在4例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌標(biāo)本中出現(xiàn)甲基化的差異基因?yàn)?3個(gè),33個(gè)基因散在分布于17條染色體上。另外,A組4例I期鼻咽癌標(biāo)本均未出現(xiàn)甲基化而B組有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌標(biāo)本中出現(xiàn)3例、2例和1例甲基化的基因數(shù)目分別為153個(gè)、658個(gè)和2340個(gè)。結(jié)論全基因組基因甲基化芯片篩選出33個(gè)鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的甲基化基因,初步構(gòu)建了鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因甲基化譜,為鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供了新的候選基因標(biāo)志物,為預(yù)防鼻咽癌的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的研究方向。第二章利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因目的本研究應(yīng)用NimbleGen人類全基因表達(dá)譜芯片技術(shù),以早期鼻咽癌和有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織標(biāo)本為研究對象,篩選鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因,建立差異表達(dá)基因譜,并對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)分析,從分子水平研究鼻咽癌發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法使用TRIzol法提取6例早期鼻咽癌組織(早期組),8例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織(轉(zhuǎn)移組)的總RNA和6例正常鼻咽黏膜組織(正常組),對樣品RNA進(jìn)行純化及質(zhì)控,然后合成及純化cDNA并標(biāo)記,再將標(biāo)記好的cDNA與NimbleGen基因表達(dá)譜芯片雜交、洗滌,經(jīng)過芯片的掃描和數(shù)據(jù)采集及標(biāo)準(zhǔn)化后,篩選出兩組鼻咽癌之間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因。結(jié)果20份樣品總RNA提取結(jié)果良好,檢測質(zhì)量合格。我們篩選出與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因共有6587個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的為3359個(gè),下調(diào)的為3228個(gè)。上調(diào)的基因分布在1號(11.10%)、2號(7.62%)、17號(6.28%)染色體最多,在Y(0.21%)、21號(0.86%)、18號(1.28%)染色體最少。下調(diào)的基因分布在1號(10.19%)、19號(8.89%)、17號(6.85%)染色體最多,在Y(0.46%)、18號(1.02%)、13號(1.39%)染色體最少。GO分析結(jié)果顯示表達(dá)上調(diào)的基因參與的生物過程(Biological Process)主要包括：細(xì)胞代謝過程(GO：0044237)、有機(jī)物代謝過程(GO：0071704)、初級代謝過程(GO：0044238)、病毒感染過程(GO：0016032)、細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)(GO：0033554)氮化合物代謝過程(GO：0006807)等；其主要分子功能(MolecularFunction)包括蛋白質(zhì)結(jié)合(GO：0005515)、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合(GO：0097159)、雜環(huán)化合物結(jié)合(GO：1901363)、酶活性(GO：0003824)、離子結(jié)合(GO：0043167)、核酸結(jié)合(GO：0003676)等；其主要參與構(gòu)成的細(xì)胞組分(Cellular Component)包括：細(xì)胞內(nèi)組分(GO：0044424)、膜結(jié)合的細(xì)胞器(GO：0043227)、胞內(nèi)細(xì)胞器(GO：0043229)、細(xì)胞質(zhì)(GO：0005737)等。表達(dá)下調(diào)的基因參與的生物過程主要包括細(xì)胞過程的調(diào)控(GO：0050794)、刺激反應(yīng)(GO：0050896)、細(xì)胞通訊(GO：0007154)系統(tǒng)發(fā)育(GO：0048731)、細(xì)胞間信號傳遞(GO：0007267)等；其主要分子功能包括受體活性(GO：0004872)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(GO：0005215)、核酸轉(zhuǎn)錄因子活性(GO：0001071)、通道活性(GO：0015267)、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合(GO：0001664)、受體激動(dòng)劑活性(GO：0048018)等；其參與的細(xì)胞組分主要是膜組分(GO：0044425)、細(xì)胞外周(GO：0071944)、細(xì)胞外間隙(GO：0005615)、角蛋白纖維(GO：0045095)等。KEGG的生物通路富集分析(Pathway Analysis)結(jié)果顯示3359個(gè)表達(dá)上調(diào)的差異基因中有1240個(gè)分別參與87條生物通路,例如病毒致癌作用(hsa05203)、EB病毒感染(hsa05169)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(hsa03013)等；3228個(gè)表達(dá)下調(diào)的差異基因中有672個(gè)分別參與33條生物通路,例如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)、癌癥異常轉(zhuǎn)錄(hsa05202)等。33個(gè)鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化基因和3228個(gè)表達(dá)下調(diào)基因進(jìn)行聯(lián)合分析,篩選出了3個(gè)負(fù)關(guān)聯(lián)的顯著表達(dá)下調(diào)的差異甲基化基因：BAZ2B、CYP2J2和ZNF628,其中CYP2J2參與KEGG生物通路中的兩條下調(diào)通路：亞油酸代謝通路(hsa00591)和卵巢類固醇生成通路(hsa04913)。3個(gè)差異甲基化基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微粒體的構(gòu)成,和與DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合等分子功能。結(jié)論本研究應(yīng)用人類全基因表達(dá)譜芯片技術(shù),篩選出與鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的3359個(gè)上調(diào)和3228下調(diào)的差異表達(dá)基因,初步建立了差異表達(dá)基因譜,并對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)分析,為研究鼻咽癌發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。對33個(gè)差異甲基化基因和3228個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因進(jìn)行聯(lián)合分析,篩選出BAZ2B、CYP2J2和ZNF628三個(gè)負(fù)關(guān)聯(lián)的顯著表達(dá)下調(diào)的差異甲基化基因,為尋找鼻咽癌理想的基因標(biāo)志物和新的治療靶位點(diǎn)提供參考。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 甲基化芯片 表達(dá)譜芯片 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-18
• 第一章 鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因甲基化譜的初步構(gòu)建18-29
• 1 材料與方法18-23
• 1.1 材料18-19
• 1.2 方法19-23
• 2 結(jié)果23-29
• 2.1 DNA質(zhì)控23-27
• 2.2 兩組鼻咽癌標(biāo)本DNA差異甲基化譜的建立27-29
• 第二章 利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因29-60
• 1 材料與方法29-35
• 1.1 材料29-31
• 1.2 方法31-35
• 2 結(jié)果35-60
• 2.1 RNA的質(zhì)控35-36
• 2.2 cDNA的質(zhì)控36-37
• 2.3 標(biāo)記的cDNA的質(zhì)控37-38
• 2.5 表達(dá)譜芯片結(jié)果38-41
• 2.6 差異表達(dá)基因的GO分析41-54
• 2.7 差異表達(dá)基因的KEGG的生物通路分析54-56
• 2.8 DNA甲基化基因和表達(dá)譜聯(lián)合分析56-60
• 討論60-74
• 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-93
• 附錄93-126
• 中英文縮略詞表126-127
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果127-128
• 致謝128-129

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 張松;李爍;高春生;;uPA基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用[J];腫瘤防治研究;2012年06期

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  本文關(guān)鍵詞：鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化基因的篩選及定位，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：381086