目的 :利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OSBPL2基因敲除的穩(wěn)定HeLa細(xì)胞株。方法 :設(shè)計3個單導(dǎo)向RNA（singleguide RNA,sg RNA）,分別靶向OSBPL2基因的第2、3和5外顯子,以PGK1.1為載體,構(gòu)建出3個重組真核表達(dá)載體。分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后,使用嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選,Cruiser TM敲除檢測實驗和測序共同檢驗載體靶向效率。選出靶向效率最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng),最后用Western blot鑒定敲除效果。結(jié)果:sg RNA正確插入到PGK1.1載體,靶向第2外顯子的重組載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并篩選單克隆后,細(xì)胞未檢測出OSBPL2蛋白的表達(dá)。結(jié)論:敲除OSBPL2基因的穩(wěn)定HeLa細(xì)胞株構(gòu)建成功。 

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【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA,sg RNA)靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈合成
        1.2.2 PGK1.1-sg RNA載體構(gòu)建
        1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.2.4 藥物篩選和細(xì)胞基因組DNA提取
        1.2.5 PCR以及CruiserTM敲除檢測實驗
        1.2.6 篩選OSBPL2基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株
        1.2.7 Western blot檢測
2 結(jié)果
    2.1 sg RNA靶點(diǎn)以及寡核苷酸序列確定
    2.2 PGK1.1-sg RNA重組載體的PCR驗證和測序結(jié)果
    2.3 藥物篩選、混合克隆測序驗證和CruiserTM敲除檢測實驗
    2.4 陽性克隆的篩選與鑒定
    2.5 Western blot檢測OSBPL2 Exon2敲除后OSB-PL2蛋白的表達(dá)
3 討論



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