成體哺乳動(dòng)物的內(nèi)耳無法再生毛細(xì)胞。人的毛細(xì)胞一旦受損或死亡便會(huì)造成永久性的聽覺和平衡覺的功能異常,甚至?xí)䦟?dǎo)致個(gè)體失聰、失衡。但是自然界中鳥類、兩棲類和硬骨魚類等非哺乳類脊椎動(dòng)物的內(nèi)耳及側(cè)線等感覺系統(tǒng)卻能終生再生毛細(xì)胞。因此,研究這些非哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞再生機(jī)制,將有助于我們了解哺乳動(dòng)物無法修復(fù)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷的內(nèi)在原因,進(jìn)而幫助尋找誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生的治療手段。本課題以斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘為研究對(duì)象,從一個(gè)側(cè)線毛細(xì)胞發(fā)育正常但再生異常的突變體sim1b^{egfp Et}入手,利用胚胎活體成像、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、顯微注射、基因編輯、免疫共沉淀等技術(shù)探討該突變體在順鉑損傷后,側(cè)線再生毛細(xì)胞異常的遺傳機(jī)制。本文研究發(fā)現(xiàn):Sim1b可直接結(jié)合部分Disheveled家族成員的調(diào)控區(qū)域進(jìn)而調(diào)控Wnt信號(hào)通路活性。其中,Sim1b正向調(diào)控dvl3a的表達(dá),促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞核中富集,進(jìn)而開啟前體細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)毛細(xì)胞的再生。與之相反,我們發(fā)現(xiàn)Sim1b負(fù)向調(diào)控dvl2和dixdc1b的表達(dá)。由于Sim1b在神經(jīng)丘中的表達(dá)起始于側(cè)線發(fā)育基本完成之后,因此sim1b^e... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的遺傳標(biāo)記（圖片改編于Raible實(shí)驗(yàn)室[49]）

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-11-sim1b是含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過結(jié)合DNA來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在神經(jīng)丘中表達(dá)最早可以追蹤到3dpf（圖1-8），在此之前sim1b表達(dá)主要集中于頭部，并不在后側(cè)線神經(jīng)丘中，這可能是它不影響側(cè)線毛細(xì)胞發(fā)育的原因之一。在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了損傷后神經(jīng)丘細(xì)胞的RNA-seq實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路下游關(guān)鍵因子dvl3a的表達(dá)相較于野生型有顯著的下降。另外，dvl3a在斑馬魚心臟和視網(wǎng)膜再生過程中均隨著時(shí)間表達(dá)升高。所以我們猜測(cè)dvl3a可能參與到后側(cè)線毛細(xì)胞的再生過程之中并且是調(diào)控斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞再生的關(guān)鍵步驟。同時(shí)本文將對(duì)sim1begfpEt突變體影響側(cè)線毛細(xì)胞的再生機(jī)制進(jìn)行初步探討。sim1begfpEt突變體可以幫助我們初步證實(shí)了再生與發(fā)育為截然不同的生命現(xiàn)象，以此為切入點(diǎn)可以幫助闡釋發(fā)育與再生之間的內(nèi)在差別。另外，研究斑馬魚后側(cè)線毛細(xì)胞的再生不僅可以為因毛細(xì)胞損傷造成的聽覺、平衡覺功能障礙的治療和遺傳檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)，還可以向毛細(xì)胞相關(guān)研究方向提出新的問題并在臨床上幫助提出新的治療策略。圖1-8sim1b在3dpf胚胎中的表達(dá)圖譜

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-28-3.2dvl3a表達(dá)降低斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞再生異常我們將0.5mM的dvl3a-MO（序列為：5’-AACTTTAGTCTCCCCCATTGCAGAC-3’）和Randomcontrol-MO（序列為：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’）分別在胚胎處于單胞期時(shí)將1nL的MO注射入卵黃中，隨后將胚胎置于28.5℃恒溫培養(yǎng)。如前文所述，5pdf的幼魚的后側(cè)線系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育成熟，所以我們選擇用5pdf的幼魚進(jìn)行后側(cè)線毛細(xì)胞的再生實(shí)驗(yàn)（本文實(shí)驗(yàn)采用的均為5dpf的幼魚，后文中將不再贅述）。斑馬魚幼魚的后側(cè)線毛細(xì)胞損傷系統(tǒng)采用0.5mM的順鉑避光浸泡處理6小時(shí)。分別在順鉑處理前（5dpf）以及順鉑處理后0h（0hpt）、12h（12hpt）、24h（24hpt）、48h（48hpt）用毛細(xì)胞特異性小分子活體染色劑YO-PRO-1室溫避光孵育30分鐘，隨后用ZEISSA2顯微鏡觀察毛細(xì)胞的再生情況，統(tǒng)計(jì)后側(cè)線系統(tǒng)中前三個(gè)神經(jīng)丘中新生毛細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)如下：注射dvl3a-MO與Randomcontrol-MO胚胎死亡率以及畸形率均沒有顯著差異。其中，斑馬魚幼魚胚胎中的后側(cè)線系統(tǒng)的發(fā)育也沒有顯著的異常，每個(gè)神經(jīng)丘中約含有13-14個(gè)毛細(xì)胞（圖3-3所示），并呈花環(huán)狀結(jié)構(gòu)排列在軀體的兩側(cè)，每一側(cè)平均形成7-8個(gè)成熟的神經(jīng)丘（圖3-2所示）。在順鉑處理后0hpt（hoursposttreatment）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們可以推斷：0.5圖3-25dpf斑馬魚后側(cè)線系統(tǒng)。在dvl3a-MO與controlMO的5dpf的胚胎中，斑馬魚的后側(cè)線系統(tǒng)可以正常發(fā)育。YO-PRO-1用于標(biāo)記斑馬魚的側(cè)線毛細(xì)胞。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3528922