目的探討P-糖蛋白對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。方法取人RPE細(xì)胞株D407細(xì)胞,放入體積分?jǐn)?shù)5%CO₂培養(yǎng)箱中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。先將細(xì)胞按H₂O₂濃度梯度處理,使用免疫印跡實(shí)驗(yàn)和P-糖蛋白熒光性底物羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)確定H₂O₂對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)濃度。預(yù)先使用1μmol·L^-1P-糖蛋白抑制劑Tariquidar處理細(xì)胞,通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)羅丹明123蓄積量檢測(cè)P-糖蛋白功能活性。將細(xì)胞分成3組:對(duì)照組、H₂O₂模型組(400μmol·L^-1)、H₂O₂+P-糖蛋白抑制劑組（H₂O₂+Tariquidar）,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞... 

【文章來(lái)源】：眼科新進(jìn)展. 2020,40(10)北大核心

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免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度H2O2處理后RPE細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)情況

檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度可以了解P-糖蛋白的功能活性。結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1 H2O2相比,200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均下降,并在400 μmol·L-1濃度時(shí)出現(xiàn)最低值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見(jiàn)圖2)。這提示200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2能有效增加P-糖蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。H2O2在濃度400 μmol·L-1時(shí)對(duì)P-糖蛋白表達(dá)和功能均有最明顯的誘導(dǎo)作用,該濃度為最佳處理濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以400 μmol·L-1 H2O2作為模型誘導(dǎo)濃度。2.3 P-糖蛋白對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4,H2O2模型組ATP水平較對(duì)照組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);而H2O2 + P-糖蛋白抑制劑組ATP水平則較H2O2模型組更低,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示抑制P-糖蛋白功能可進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的ATP水平下降。圖4 熒光素/熒光素酶ATP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組D407細(xì)胞內(nèi)ATP水平


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