本文關(guān)鍵詞：Munc18-1在小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的定位表達(dá)及調(diào)控突觸囊泡胞吐的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著老齡化社會的發(fā)展,聽障人口逐年增加,感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss,SNHL)已成為目前人類面臨的主要健康問題之一[1],也是耳鼻喉科�？萍膊≈委煹闹攸c(diǎn)和難點(diǎn)。雖然近期有大量關(guān)于SNHL發(fā)病病理[2]、毛細(xì)胞再生、支持細(xì)胞、干細(xì)胞轉(zhuǎn)化治療等相關(guān)研究報(bào)道,但其發(fā)病機(jī)制和治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)[3]。SNHL可細(xì)分為感音性和神經(jīng)性[4],內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cells,IHCs)的突觸是外界聲刺激通過聽覺神經(jīng)傳遞至聽覺中樞的第一站,若其發(fā)生病變,將導(dǎo)致IHCs聲刺激-電信號轉(zhuǎn)換障礙,而引起耳蝸感音性受損,但因兩者臨床表現(xiàn)極其相似,臨床上無法嚴(yán)格區(qū)分。IHCs能夠?qū)⒉煌l率、響度的聲音不知疲倦地轉(zhuǎn)換成瞬息、精確、分級的谷氨酸遞質(zhì)釋放,來激活突觸后受體產(chǎn)生動作電位。IHCs的突觸不同于傳統(tǒng)神經(jīng)突觸,在電鏡下呈“帶狀”,稱為帶狀突觸,主要構(gòu)成蛋白為Ribeye/CtBP2[5,6],周圍捆綁大約70-200個(gè)囊泡,縮短了囊泡與細(xì)胞膜的距離,形似“運(yùn)輸帶”一樣,能夠源源不斷地將裝配好的囊泡運(yùn)輸?shù)酵挥|前活化位點(diǎn),促進(jìn)囊泡同步釋放,來維持IHCs持續(xù)分泌神經(jīng)遞質(zhì),以應(yīng)對各級聲刺激。對IHCs突觸蛋白構(gòu)成的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),其與傳統(tǒng)的神經(jīng)元突觸有很大的不同,比如synaptotagmins 1-2、complexins、Munc13-1等傳統(tǒng)神經(jīng)元必需的突觸蛋白[7-9],而在IHCs中是缺失的,且雇傭了特殊的蛋白Vglut3、otoferlin等參與突觸執(zhí)行功能[10-12]。IHCs與聽神經(jīng)之間的信息交流和大多數(shù)化學(xué)突觸一樣的,在IHCs胞內(nèi),神經(jīng)遞質(zhì)被包裝到突觸囊泡(synaptic vesicles,SVs)內(nèi),當(dāng)動作電位來臨時(shí),激活并打開突觸前電壓門控Ca2+通道,Ca2+觸發(fā)胞吐,遞質(zhì)釋放到突觸間隙激活聽神經(jīng)末梢相應(yīng)受體從而產(chǎn)生神經(jīng)沖動傳遞的。突觸胞吐主要包括兩個(gè)步驟:SV鉚釘和與突觸前膜的融合。SV鉚釘是指囊泡吸附到胞膜活化區(qū),SVs在融合之前需要預(yù)準(zhǔn)備即啟動,然后Ca2+觸發(fā)融合孔道開放完成融合[13]。胞吐的最終階段即SVs的膜融合成為了遞質(zhì)分泌的重要前提[13,14]。研究表明SVs胞吐需要許多進(jìn)化保守的蛋白參與整個(gè)過程的一系列步驟,其中主要有[15-17]:SNARE蛋白synaptobrevin、syntaxin-1和SNAP-25形成SNARE復(fù)合體,負(fù)責(zé)將囊泡和細(xì)胞質(zhì)膜粘貼在一起促進(jìn)融合;Munc18-1同時(shí)與“關(guān)閉”構(gòu)象的syntaxin-1和snare復(fù)合體銜接調(diào)控上述四種蛋白的裝配[18];及ca2+敏感蛋白synaptotagmin-1啟動融合。munc18-1是sec1/munc18(sm)蛋白家族的成員,約60-70kda多肽氨基酸鏈,包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域,形成含有中央腔隙的拱橋形,“關(guān)閉”構(gòu)象的syntaxin-1即位于其中央?yún)^(qū)[16]。關(guān)于munc18-1功能的報(bào)道目前主要包括:作為syntaxin-1的伴侶分子,協(xié)助其正確的定位和表達(dá)[18-20];啟動或促進(jìn)snare蛋白參與的胞吐過程[21-23];輔助大而擁有致密核心的囊泡鉚釘?shù)洁徑募?xì)胞膜[24]。近年通過對體外脂質(zhì)體融合試驗(yàn)的研究[25]發(fā)現(xiàn),膜融合起始于munc18-1-syntaxin-1二聚體的形成,且已有報(bào)道證實(shí)了敲除munc18-1基因后,突變小鼠中樞神經(jīng)元及神經(jīng)肌肉接頭的突觸徹底失去了分泌神經(jīng)遞質(zhì)的能力[26],蛋白激酶c(proteinkinasec,pkc)能夠使munc18-1的ser-313位點(diǎn)磷酸化而促進(jìn)嗜鉻細(xì)胞分泌[27],并且munc18-1在神經(jīng)元末梢的募集反應(yīng)受pkc影響,在中樞神經(jīng)遞質(zhì)分泌短時(shí)程增強(qiáng)過程中munc18-1受pkc動態(tài)調(diào)控[28,29],可見munc18-1是svs胞吐的關(guān)鍵蛋白,且受胞內(nèi)pkc磷酸化的影響。雖然針對munc18-1蛋白的研究已有很多報(bào)道,但目前大部分局限于嗜鉻細(xì)胞、pc12細(xì)胞、中樞神經(jīng)元,而關(guān)于ihcs突觸囊泡胞吐的研究相對較少。研究者通過比較ihcs、視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)的突觸后發(fā)現(xiàn)ihcs中也有munc18-1、syntaxin-1、snare等蛋白的表達(dá)[30],但munc18-1在胞內(nèi)具體的分布、定位并沒有詳細(xì)的闡明,且其在ihcs中是否同樣起到調(diào)控svs的胞吐,與聽覺的發(fā)育有無關(guān)系仍不清楚。我們知道細(xì)胞膜是由具有絕緣性的脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成,于是胞外液-膜-胞內(nèi)液即形成膜電容(membranecapacitance,cm)[31],cm=πd2/100(pf),d=細(xì)胞的直徑(μm),與細(xì)胞膜的表面積成正比。刺激ihcs胞吐的過程中,必需囊泡與突觸前膜融合,遞質(zhì)才能通過融合孔道釋放到突觸間隙,融合的同時(shí)胞膜的表面積即相應(yīng)增大,伴隨著cm也增大。而電生理膜片鉗技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測cm,已成為研究ihcs胞吐的重要手段[6,32,33]。本實(shí)驗(yàn)首先通過免疫熒光標(biāo)記、激光共聚焦成像技術(shù),分別檢測成年小鼠耳蝸ihcs中munc18-1的表達(dá)、定位及其同帶狀突觸ribeye/ctbp2的關(guān)系;其次通過實(shí)時(shí)熒光定量qrt-pcr檢測,比較出生后第6、12、18天(p6、p12、p18)的小鼠耳蝸munc18-1基因的相對表達(dá)變化,觀察munc18-1與聽力成熟的關(guān)系;最后采用電生理膜片鉗技術(shù),觀察抑制和激活內(nèi)源性pkc介導(dǎo)munc18-1的磷酸化對急性分離的ihcs鈣電流(ica)、cm的影響,對munc18-1調(diào)控ihcs突觸囊泡分泌的作用做初步的探討。結(jié)果:1、激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn),munc18-1熒光標(biāo)記顯示在ihcs胞質(zhì)中有高濃度的表達(dá),munc18-1與ctbp2雙標(biāo)提示munc18-1蛋白主要在核下區(qū)及ctbp2周圍,核下區(qū)Munc18-1的IMV值強(qiáng)于核上區(qū),P0.05有差異;2、實(shí)時(shí)熒光定量q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),P6、P12、P18三個(gè)年齡段的小鼠耳蝸Munc18-1蛋白的表達(dá)量無差異,P0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3、膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),IHCs給予PKC抑制劑作用后的動作電位發(fā)放頻率(APf)較對照組(給藥前)減少,P0.05有差異;同時(shí)作用后的膜電容變化量(△Cm)較之前減小,P0.05;接著再給予PKC激動劑作用于IHCs后發(fā)現(xiàn)APf較之前2組(對照組、PKC抑制劑組)均增多,△Cm增大,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:本研究表明:內(nèi)毛細(xì)胞中有Munc18-1蛋白表達(dá),且聚集在核下區(qū)、帶狀突觸附近;Munc18-1蛋白是IHCs突觸囊泡胞吐不可或缺的蛋白,未成熟IHCs中即有表達(dá),但與聽力發(fā)育的關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證;通過抑制和激動PKC發(fā)現(xiàn)對IHCs的AP發(fā)放頻率及膜電容有影響,可能是通過內(nèi)源性PKC介導(dǎo)Munc18-1的磷酸化來影響IHCs突觸囊泡的胞吐。
【關(guān)鍵詞】：Munc18-1蛋白 Ct BP2蛋白 內(nèi)毛細(xì)胞 PKC 電生理
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764.35
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 Munc18-1 蛋白在小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的定位表達(dá)17-24
• 2.1 材料與方法17-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-21
• 2.3 討論21-23
• 2.4 小結(jié)23-24
• 第三章 Munc18-1 蛋白與小鼠聽力發(fā)育相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究24-30
• 3.1 材料與方法24-27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-28
• 3.3 討論28-29
• 3.4 小結(jié)29-30
• 第四章 PKC介導(dǎo)的Munc18-1 磷酸化對內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡胞吐的影響30-41
• 4.1 材料與方法31-34
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 4.3 討論38-40
• 4.4 小結(jié)40-41
• 全文結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-50
• 文獻(xiàn)綜述Munc18-1 蛋白調(diào)控突觸囊泡胞吐的研究進(jìn)展50-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文63-64
• 致謝64-65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 唐s，

本文編號：320069