目的:真菌性角膜炎（Aspergillus fumigatus,AF）是由致病真菌侵犯受損角膜導(dǎo)致的感染性角膜炎,是因缺乏有效的治療的棘手疾病之一。細(xì)胞焦亡在抵御微生物入侵的先天免疫階段中發(fā)揮著重要作用。GSDMD蛋白是焦亡過程中關(guān)鍵執(zhí)行者,也是不同焦亡途徑的通用底物。本研究中,我們重在探究GSDMD蛋白在由煙曲霉菌誘導(dǎo)的小鼠真菌性角膜炎中的作用及機(jī)制。方法:1.收集臨床上感染真菌性角膜炎患者和正常對照組患者的角膜組織,采用免疫熒光法檢測非感染和感染真菌的人角膜中GSDMD蛋白的表達(dá)。使用煙曲霉菌分生孢子刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞（Human corneal epithelium cells,HCECs）,通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-PCR RT-PCR）和Western Bolt法檢測正常和煙曲霉菌刺激4h、8h、12h、16h的HCECs中GSDMD蛋白的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光法檢驗(yàn)正常和煙曲霉菌刺激8h后的HCECs中GSDMD蛋白的表達(dá)。2.基質(zhì)內(nèi)注入煙曲霉菌分生孢子建立12h、1d、2d、3d、5d、7d、10d、14d小鼠真菌性角膜炎動(dòng)物模... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

（A-C）煙曲霉菌菌絲及分生孢子形態(tài)

結(jié)果16圖2.（A-B）是對GSDMD進(jìn)行免疫熒光染色，綠色的代表GSDMD，藍(lán)色的代表DAPI。（A）為在健康人角膜組織中GSDMD的表達(dá)；（B）為在確診為真菌性角膜炎患者的角膜組織中GSDMD的表達(dá)。2.2煙曲霉菌刺激人角膜上皮細(xì)胞中GSDMD的表達(dá)用煙曲霉分生孢子刺激HCECs8h后，采用細(xì)胞免疫熒光法處理細(xì)胞，檢測HCECs中GSDMD蛋白的定位和表達(dá)。結(jié)果如圖顯示（圖3.A-B），細(xì)胞中的GSDMD蛋白在煙曲霉菌刺激后表達(dá)明顯增加，且主要表達(dá)在胞膜和胞質(zhì)中。收集真菌孢子刺激4h、8h、12h和16h的細(xì)胞，用于PCR法檢測HCECs中GSDMD的表達(dá)變化（圖3.C）。觀察到GSDMD的mRNA水平從感染真菌4h后逐漸增高，并在感染12h時(shí)達(dá)到峰值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。收集真菌孢子刺激8h、12h和16h的細(xì)胞，進(jìn)一步用WesternBlot法驗(yàn)證（圖3.D），與正常組比在感染真菌8h、12h和16h后細(xì)胞中GSDMD-p30的蛋白水平逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2.（A-D）感染煙曲霉菌HCECs中GSDMD的表達(dá)。（A-B）對GSDMD進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，綠色代表GSDMD，藍(lán)色代表DAPI。（C）和（D）分別從mRNA和蛋白水平對GSDMD進(jìn)行檢測。3.小鼠煙曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表達(dá)3.1小鼠煙曲霉菌性角膜炎的臨床觀察建立小鼠真菌性角膜炎動(dòng)物模型，感染后定期裂隙燈下觀察角膜的感染情況（圖3.A），發(fā)現(xiàn)感染真菌1d后結(jié)膜開始充血，角膜水腫，感染處見輕度白色混濁，邊界

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文17不清。隨時(shí)間的延長，角膜混濁逐步加重，漸有潰瘍形成至呈現(xiàn)龕樣潰瘍、穿孔或后彈力層膨出。后隨病程的發(fā)展，炎癥逐漸減輕，潰瘍區(qū)瘢痕愈合，新生血管長入，最終遺留厚薄不等的瘢痕。臨床評分結(jié)果也顯示（圖3.B）,感染后1d臨床評分開始逐步升高，5d達(dá)到峰值，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與裂隙燈下所見結(jié)果基本一致。圖3.（A-B）小鼠真菌性角膜炎的鏡下表現(xiàn)及臨床評分。（A）為煙曲霉菌感染小鼠角膜后的裂隙燈照相；（B）為小鼠真菌性角膜炎的對應(yīng)臨床評分。3.2小鼠煙曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表達(dá)為研究GSDMD是否參與小鼠真菌性角膜炎的免疫過程，收集角膜樣本，采用PCR和WesternBlot檢測GSDMD的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常組相比，在感染12h后小鼠角膜中的GSDMD的mRNA水平逐漸升高，至第5天達(dá)到峰值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其后至14天，GSDMD表達(dá)逐漸下降（圖3.A）。WesternBlot結(jié)果也顯示了，小鼠角膜中的GSDMD-p30的蛋白水平從感染12h后開始增加，至5d達(dá)最高峰，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PCR的變化趨勢基本一致（圖3.B）。我們進(jìn)一步使用免疫熒光染色檢測正常和煙曲霉感染1d的小鼠角膜中的GSDMD蛋白的表達(dá)和定位。正常未感染的小鼠角膜中幾乎見不到GSDMD染色（圖3.C），而感染1d的小鼠角膜中GSDMD的綠色熒光明顯增加，且多表現(xiàn)在角膜的上皮及基質(zhì)層（圖3.D）。

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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碩士論文
[1]日本血吸蟲感染所致肝臟肉芽腫性炎癥中的細(xì)胞焦亡研究[D]. 林桂瑩.廣州醫(yī)科大學(xué) 2018



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