目的:目前聽力損失是影響全球人類健康的重要原因之一,據(jù)2013年世界衛(wèi)生組織（The Word Health,WHO）數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示,目前全世界聽力障礙患者大約有36,000萬,約占總?cè)丝诘?.3%,其中15歲以下聽障患兒約有3,200萬。根據(jù)病因可以將聽力損失分為先天性和后天性兩種,其中先天性聽力損失主要包括遺傳性聾,而后天性聽力損失主要包括噪聲誘導(dǎo)的聽力損失、耳毒性藥物誘導(dǎo)的聽力損失以及老年性聾等。因此,盡早完善與聽力損失相關(guān)的基因突變譜,并通過基因篩查與診斷提早進(jìn)行患病風(fēng)險(xiǎn)的評估和預(yù)防,將對最終降低我國人口聽力損失發(fā)病率、提高人口質(zhì)量具有重大意義。不論是先天性還是后天性,導(dǎo)致最終聽力損失的原因都是阻斷了聲音在聽覺傳導(dǎo)通路的正常傳遞。聽覺傳導(dǎo)通路主要分為外周聽覺傳導(dǎo)通路和中樞傳導(dǎo)通路,其中外周聽覺系統(tǒng)傳導(dǎo)通路為:外界聲音從外耳道通過鼓膜,將聲音傳遞至中耳,再通過聽小骨振動將聲音信號放大并傳遞至卵圓窗,并通過淋巴液的振動傳遞刺激耳蝸Corti器。中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導(dǎo)通路為:耳蝸Corti器中的外毛細(xì)胞接受到刺激之后將聲音信號放大,刺激內(nèi)毛細(xì)胞將聲音信號通過突觸進(jìn)行編碼,然后沿著耳蝸... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

Fgf22基因信息圖

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文11圖1.2共聚焦顯微鏡下帶狀突觸數(shù)量計(jì)數(shù)示意圖a-c.耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸前后膜蛋白標(biāo)記結(jié)果，提示正常突觸信號存在于內(nèi)毛細(xì)胞底部；d-e.沿z軸層掃突觸帶模式圖，掃描層距為0.35μm；e.空間分布下突觸帶沿著z軸掃面的分布情況；f.將全耳蝸所有掃描結(jié)果疊加后，合成3D示意圖(引自keliuetal.Molneurobiol.2013)；（3）激光共聚焦顯微鏡成像：將標(biāo)本置于激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司TCSSP5II）下觀察，采用10×目鏡和63×油鏡分別觀察，激發(fā)光波長分別使用358nm和488nm。成像過程中沿著從頂回向底回方向依次掃描，相鄰兩個(gè)掃描區(qū)域以大約10個(gè)毛細(xì)胞的間距分隔開，再連續(xù)觀察每一個(gè)層的圖像，并疊加各層的最大灰度值，最后使全部信號在都疊加在同一層面上，從而便于突觸數(shù)量的觀察與計(jì)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的掃描層距為0.35μm；（4）耳蝸帶狀突觸數(shù)目計(jì)數(shù)以及定位：首先將激光共聚焦顯微鏡掃描的耳蝸圖片從頂回向底回按照掃描的順序進(jìn)行編號（eg:n=0、1、2、3……、m），然后分別計(jì)數(shù)突觸后綠色熒光和突觸前紅色熒光通道所示信號，并運(yùn)用ImageJ軟件計(jì)數(shù)，對每一幅圖片所得信號總數(shù)除以毛細(xì)胞的總數(shù)目，也就得到了這個(gè)區(qū)域中單個(gè)毛細(xì)胞對應(yīng)的突觸數(shù)量。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文13圖1.3將Cas9及sgRNA顯微注射進(jìn)入受精卵構(gòu)建Fgf22基因缺陷模型A.準(zhǔn)備顯微注射進(jìn)入受精卵；B.正在進(jìn)行顯微注射進(jìn)入受精卵（圖片由徐州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供）；2.4.8Fgf22基因敲除小鼠基因型鑒定（1）提取鼠尾DNA組織1）首先剪取鼠尾組織0.5-1cm,放入無酶EP管中，加入200-300μl緩沖液GA,隨后溶解液中再加入20μlProteinaseK溶液；2）在56℃水浴鍋中消化過夜，直至所有的團(tuán)塊都全部消失；3）隨后加入200μl緩沖液GB，上下充分顛倒混勻，70℃烤箱內(nèi)放置10分鐘，待溶液應(yīng)變清亮，輕度離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；4）隨后每個(gè)EP管中加人200μl無水乙醇，充分振蕩混勻大約15秒，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；5）此時(shí)需要將上一步所得溶液和絮狀沉淀全部都倒入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），進(jìn)行12,000rpm(~13,400×g)離心30秒，隨后倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；6）再向吸附柱CB3中加入500μl的緩沖液GD，進(jìn)行12,000rpm(~13,400×g)離心30秒之后倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；7）隨后向吸附柱CB3中加入600μl的漂洗液PW，進(jìn)行12,000rpm(~13,400×g)離心30秒后，倒掉上層廢液，然后將吸附柱CB3放入到收集管中；8）重復(fù)步驟7；9）然后將吸附柱CB3放再放置于收集管中，12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘后，倒掉廢液，再將吸附柱CB3在常溫下放置3-5分鐘；10）然后將上一步驟中的吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無菌的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加100μl左右的洗脫緩沖液TE，室溫放置大約3-5min后，進(jìn)行12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘，最后將溶液收集到離心管中；


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