目的構(gòu)建表達(dá)視覺系統(tǒng)同源框2（VSX2）增強(qiáng)綠色熒光蛋白（eGFP）報(bào)告基因的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（hiPSCs）。方法根據(jù)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（CRISPR/Cas9）技術(shù)原理,設(shè)計(jì)VSX2的小向?qū)NA（sgRNA）,構(gòu)建敲除質(zhì)粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供體質(zhì)粒;2個(gè)質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定后電轉(zhuǎn)野生BC1-hiPSCs細(xì)胞系,采用嘌呤霉素篩選獲得單克隆,擴(kuò)增培養(yǎng)并鑒定。采用PCR和Sanger測序鑒定基因型;采用核型分析法分析報(bào)告細(xì)胞系核型;采用STR法排除細(xì)胞交叉污染;采用免疫熒光法及逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測報(bào)告細(xì)胞系的多能干細(xì)胞分子標(biāo)志物的表達(dá);通過體外三胚層形成實(shí)驗(yàn)鑒定報(bào)告細(xì)胞系向三胚層分化的能力;應(yīng)用3D視網(wǎng)膜類器官誘導(dǎo)技術(shù)獲得視網(wǎng)膜類器官,并采用免疫熒光染色法評價(jià)VSX2蛋白與eGFP的共定位情況。結(jié)果電轉(zhuǎn)后通過PCR鑒定和Sanger測序成功篩選到1株含有VSX2-eGFP報(bào)告基因的hiPSC系。核型分析結(jié)果顯示該報(bào)告細(xì)胞系核型正常。STR鑒定結(jié)果表明,BC1-VSX2eGFP-iPSCs無細(xì)胞系交叉污染。逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測和免疫熒光染色表明,BC1-VSX... 

【文章來源】：中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志. 2020,38(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁


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