本文關(guān)鍵詞：葉酸靶向共載TFPI-2及順鉑磁性納米復(fù)合物的制備及靶向治療鼻咽癌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部常見惡性腫瘤,其發(fā)病率以我國的南方較高。放射治療是NPC首選治療手段。雖然放療技術(shù)和設(shè)備不斷地更新,晚期NPC單純放射治療的平均5年生存率大概52%。放化療相結(jié)合的綜合治療為目前臨床最常應(yīng)用的方法,但由于腫瘤轉(zhuǎn)移、多重耐藥及化療藥物的不良反應(yīng)等原因,總的生存率仍不理想。近年來,化療在鼻咽癌的治療作用越來越受到重視�；熤饕抢没瘜W(xué)藥物抑制癌細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移,最終促使癌細(xì)胞凋亡壞死的一種治療方式。然而化療藥物的選擇性弱,在促使癌細(xì)胞凋亡壞死的同時也會損傷人體正常細(xì)胞,不可避免的產(chǎn)生藥物的不良反應(yīng)。順鉑(cisplatin,CDDP)是最常用的廣譜抗腫瘤化療藥物之一,具有抗癌活性高、抗癌作用強(qiáng)等特點(diǎn),可與5-氟尿嘧啶(5-FU)等多種抗癌藥物聯(lián)合使用,可產(chǎn)生協(xié)同作用且無明顯交叉耐藥的特點(diǎn),被推薦治療非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、頭頸部癌和卵巢癌等癌癥的首選藥物。和許多其他的抗腫瘤藥物一樣,CDDP在臨床中存在靶向性低,副作用大,如腎臟毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等,水溶性低及在體內(nèi)代謝速度快等缺點(diǎn)限制了其治療指數(shù)的提高。已有很多研究采用相關(guān)材料,如利用聚天冬氨酸的衍生物,聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),聚天冬氨(poly(asparticacid), PASP)作為藥物載體。所得載CDDP藥物能降低CDDP的細(xì)胞毒性,并提高抗癌活性,但此載體存在載藥效率不高、載體合成困難等問題,且缺乏特異性分子主動靶向性。腫瘤基因治療以改變?nèi)梭w遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ),將具有治療作用的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,直接針對腫瘤的異常的基因而發(fā)揮治療腫瘤的作用。基因治療開辟了治療腫瘤的新途徑,靶向基因治療及化療的聯(lián)合應(yīng)用在NPC治療中顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。組織途徑抑制因子2(Tissue facor pathway inhibitor-2, TFPI-2)是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制物,能有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase, MMP)家族的蛋白水解酶活性,在維持細(xì)胞外基質(zhì)(Matrixmetalloproteinase, ECM)的結(jié)構(gòu)完整,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)凋亡等方面起重要作用。TFPI-2廣泛分布于在人體肝臟、腎臟、心臟、骨骼肌等正常組織中,而在腫瘤組織如宮頸癌、胰腺癌中TFPI-2的表達(dá)降低,而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們課題組也發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中TFPI-2表達(dá)下降,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織TFPI-2表達(dá)水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織。以前的研究表明TFPI-2能明顯抑制肺癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞等的侵蝕轉(zhuǎn)移。但以前所廣泛采用的脂質(zhì)體載體毒性較大,病毒載體轉(zhuǎn)染率不理想,而且存在病毒活化的危險,且缺乏靶向性。我們課題組研究發(fā)現(xiàn),葉酸受體(folate receptor, FR)在人體鼻咽癌組織及HNE-1細(xì)胞中高度表達(dá),并隨著鼻咽癌臨床分期增加而表達(dá)增加,而在正常鼻粘膜組織中FR不表達(dá),FR已經(jīng)成為多種惡性腫瘤的研究靶點(diǎn)。葉酸(folic acid,FA)是人體細(xì)胞一種必需的維生素,與葉酸受體具有高度親和性,且FA與其他分子偶聯(lián)后仍可保持與FR的親和性,并通過胞吞作用特異性的攝入細(xì)胞內(nèi)。已報道的偶聯(lián)FA的基因載體有FA-EPOPC:CHOL、FA-PEG-PEI等,與未偶聯(lián)FA的載體比較,對FR陽性的HEK293T細(xì)胞、C6細(xì)胞和KB細(xì)胞能特異性的提高基因轉(zhuǎn)染效率,抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)。葉酸靶向載化療藥物(如阿霉素、紫杉醇)能選擇性的識別并靶向進(jìn)入.bel 7402細(xì)胞、KB細(xì)胞及裸鼠移植瘤,可明顯增加抗腫瘤效應(yīng)。FA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)胞吞機(jī)制及FR表達(dá)的組織分布特點(diǎn)為惡性腫瘤的靶向載藥和釋藥奠定了理論基礎(chǔ),為增強(qiáng)常規(guī)化療和基因治療的特異性提供了條件。磁性納米具有納米粒的一般特性,如粒徑小、表面曲率大等,還具有磁場靶向性。已有研究發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)FA的磁性納米粒子可特異性地到達(dá)腫瘤靶組織,可用于腫瘤的診斷和治療。基因與納米粒子結(jié)合后,可以更有效的保護(hù)基因,提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率,靶向定位輸送。我們課題組已制備出具有葉酸靶向效應(yīng)的磁性納米載體,并進(jìn)行了載順鉑靶向治療NPC的研究,穩(wěn)定性好,治療效果滿意。但該納米載體帶負(fù)電荷,難于吸附帶負(fù)電荷的基因。多聚乙烯基亞胺(Polyethyleneimine,PEI)是人工合成的具有極高密度正電荷的有機(jī)高分子陽離子聚合物,可與DNA通過正負(fù)電荷作用相互吸引而形成穩(wěn)定的復(fù)合物,且可被細(xì)胞所攝取。然而PEI具有較大的細(xì)胞毒性,并且PEI/DNA復(fù)合物溶解性欠佳限制了其作為基因載體的應(yīng)用。有研究顯示,如果將陽離子共聚物鏈接上非離子的親水性基團(tuán),如聚乙二醇(PEG),不僅可改善溶解性的問題,還可降低藥物載體的細(xì)胞毒性,延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時間、減少非特異性吸附等。已有實(shí)驗合成PEI-PEG共聚物包裹Fe304納米顆粒為基因載體,但缺乏高效分子靶向性。我們采用酰胺化反應(yīng)制備了MPEG-PEI-FA共聚物,并將其作為表面改性劑,與帶負(fù)電荷的醛基化海藻酸鈉改性的Fe304納米顆粒連接,以其作為CDDP和基因載體,通過化學(xué)反應(yīng)和靜電吸附作用將CDDP和基因連接在載體內(nèi),成功制備了共載CDDP與TFPI-2基因的葉酸靶向磁性納米復(fù)合物,以葉酸受體陽性的HNE-1和葉酸受體陰性的CNE-2鼻咽癌細(xì)胞作為研究對象,通過體內(nèi)外實(shí)驗研究該磁性納米復(fù)合物的葉酸分子靶向性及綜合抑癌效果。研究目的構(gòu)建葉酸(folic acid, FA)分子靶向載組織途徑抑制因子2(TFPI-2)及順鉑(cisplatin,CDDP)的磁性納米(magnetic nanoparticles,MNP)復(fù)合物(FA-MNP/CDDP/TFPI-2),研究該復(fù)合物對葉酸受體(folate receptor, FR)陽性鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)的分子靶向性及綜合抑制能力。研究方法1.制備FA-MNP/CDDP/TFPI-2通過化學(xué)共沉淀法制備載順鉑的磁性納米復(fù)合物MNP-CDDP和酰胺化反應(yīng)制備、酰胺化反應(yīng)制備FA(-MEPG-PEI)/TFPI-2,再通過靜電吸附合成最后通過靜電吸附合成FA-MNP/CDDP/TFPI-2。2. FA-MNP/CDDP/TFPI-2表征分別通過透射電鏡、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜、激光粒度儀觀察復(fù)合物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、粒徑大小及zeta電位,鄰苯二胺(o-phenylenediamine, OPDA)法與紫外分光光譜分析分別檢測復(fù)合物中CDDP與FA含量,瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒與磁性納米載體最佳結(jié)合的情況。3.體外實(shí)驗體外實(shí)驗采用普魯士藍(lán)鐵染色(Prussian blue staining)及熒光顯微鏡觀察NPCFR陽性HNE-1細(xì)胞及FR陰性CNE-2胞內(nèi)FA-MNP/CDDP/TFPI-2攝取及TFPI-2質(zhì)粒表達(dá)情況。通過流式細(xì)胞儀檢測載體基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步分析磁性納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染TFPI-2質(zhì)粒的情況。RT-PCR和Western blot法檢測HNE-1和CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFPI-2質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)TFPI-2 mRNA和蛋白表達(dá)情況。采用CCK-8實(shí)驗、Matrigel體外侵襲實(shí)驗及流式細(xì)胞實(shí)驗檢測FA-MNP/CDDP/TFPI-2對HNE-1細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖及凋亡的影響。4.體內(nèi)實(shí)驗體內(nèi)實(shí)驗采用活體成像及核磁共振(MRI)觀察荷瘤裸鼠尾靜脈注射FA-MNP/CDDP/TFPI-2后,同時種荷HNE-1和CNE-2兩種瘤的裸鼠種植瘤吞噬該復(fù)合物情況。Tunnel實(shí)驗觀察尾靜脈注射FA-MNP/CDDP/TFPI-2后,同時觀察荷HNE-1和CNE-2兩種瘤組織中細(xì)胞的凋亡壞死情況。實(shí)驗結(jié)果磁性納米復(fù)合物成功合成,透射電鏡顯示磁性納米粒分散均勻,呈球形,單個磁核約9nm。FA-MNP/CDDP/TFPI-2平均水動力學(xué)粒徑為151 nm, Zeta電位+15.4 mV。復(fù)合物中CDDP的含量平均為150ug/ml,包封率為37.25%。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示磁性納米載體與質(zhì)粒在質(zhì)量比10：1時能有效結(jié)合并保護(hù)質(zhì)粒。熒光顯微鏡下HNE-1細(xì)胞內(nèi)可見有較強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá),約37.4%,而CNE-2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較弱,約27.2%,提示FA-MNP/CDDP/TFPI-2獲得靶向轉(zhuǎn)染。普魯士鐵染色結(jié)果也顯示HNE-1攝取的磁性納米復(fù)合物明顯比CNE-2多。HNE-1轉(zhuǎn)染載TFPI-2質(zhì)粒復(fù)合物后,細(xì)胞內(nèi)TFPI-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。FA-MNP/CDDP/TFPI-2共培養(yǎng)組細(xì)胞生長抑制率及凋亡率分別為37.2%和44.6%,均明顯高于FA-MNP/CDDP對照組(23.4%,32.7%)和FA-MNP /TFPI-2組(17.3%,13.9%)。Matrigel侵襲實(shí)驗顯示FA-MNP/CDDP/TFPI-2組比對照組HNE-1細(xì)胞侵襲能力明顯降低。流式檢測FA-MNP/CDDP/TFPI-2阻止細(xì)胞增殖主要在S期及G2期�；铙w成像顯示FA-MNP/CDDP/TFPI-2靶向到達(dá)FR陽性的HNE-1瘤塊,而FR陰性的CNE-2瘤塊未見明顯標(biāo)記的綠色熒光蛋白的表達(dá)。核磁共振顯示FA-MNP/CDDP/TFPI-2在T2條件下HNE-1瘤塊比CNE-2瘤塊信號明顯降低。。Tunnel實(shí)驗提示FA-MNP/CDDP/TFPI-2尾靜脈注射23d后,荷瘤鼠HNE-1瘤塊比CNE-2瘤塊內(nèi)的細(xì)胞調(diào)亡明顯。結(jié)論成功構(gòu)建了具有葉酸(FA)分子靶向性能的共載基因(TFPI-2)及順鉑(CDDP)的磁性納米復(fù)合物(FA-MNP/CDDP/TFPI-2),體內(nèi)外實(shí)驗顯示對葉酸受體陽性HNE-1細(xì)胞具有良好的綜合抑制效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 磁性納米 靶向性 順鉑 葉酸 組織途徑抑制因子2(TFPI-2)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 磁性納米復(fù)合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)的制備與表征20-38
• 1. 材料與方法21-28
• 2. 結(jié)果28-32
• 3. 討論32-33
• 4. 結(jié)論33
• 參考文獻(xiàn)33-38
• 第二部分 磁性納米復(fù)合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)對鼻咽癌的靶向性實(shí)驗研究38-56
• 1. 材料與方法39-47
• 2. 結(jié)果47-52
• 3. 討論52-53
• 4. 結(jié)論53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 第三部分 磁性納米復(fù)合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)對鼻咽癌抑制實(shí)驗56-72
• 1. 材料與方法57-63
• 2. 結(jié)果63-67
• 3. 討論67-68
• 4. 結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 全文總結(jié)72-73
• 主要英文縮略詞表73-74
• 攻讀學(xué)位期間成果74-75
• 致謝75-76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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  本文關(guān)鍵詞：葉酸靶向共載TFPI-2及順鉑磁性納米復(fù)合物的制備及靶向治療鼻咽癌的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：291725