目的：探討CDK5/P35在耳蝸組織的空間表達(dá)情況，以及在耳毒性模型中是否通過激活周期素依賴性蛋白激酶5（Cyclin Dependent Kinase-5, CDK5）信號(hào)通路而引起耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，以期對(duì)該通路誘發(fā)的耳聾的干預(yù)。方法：首先用免疫熒光組織化學(xué)法、Western Blot、PCR的方法同時(shí)證實(shí)了在大鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞確實(shí)存在CDK5及其激活劑P35的表達(dá)。急性毛細(xì)胞體外給藥檢測(cè)硫酸卡那霉素是否造成毛細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上調(diào)而引起鈣超載。在此基礎(chǔ)上，利用體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞耳毒性損傷模型，以出生后4天乳大鼠耳蝸基底膜分離進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集蛋白，Western Blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞死亡的上游分子Calpain以及CDK5與P35的變化。體外培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組，硫酸卡那霉素處理組，硫酸卡那霉素加Roscovitine組，各組同時(shí)培養(yǎng)8h，后進(jìn)行PI染色，觀察細(xì)胞死亡的水平。結(jié)果：1.在大鼠耳蝸毛細(xì)胞中，螺旋器部分CDK5/P35的免疫熒光組織化學(xué)、WesternBlot、PCR、體外激酶反應(yīng)結(jié)果均呈陽性；2.體外急性給予KM會(huì)導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

鈣超載激活Calpain/CDK5/P35信號(hào)通路

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文4．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年 SD 大鼠及出生后 4 天 SPF 級(jí)乳大鼠均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)中心提供。5．實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及主要實(shí)驗(yàn)方法5.1 實(shí)驗(yàn)方案具體設(shè)計(jì)如下圖所示（圖 1）：CDK5 參與調(diào)控耳毒性藥物引起的耳蝸毛細(xì)胞

圖 2. 基底膜鋪片法熒光雙標(biāo)將組織切片在室溫干燥 20min（基底膜鋪片法可省去此步）；PBS-0.1% Triton X-100 室溫緩慢振搖 30min；棄去前液，用 10%羊血清室溫封閉 1 h (不含 NaN3，用 PBS一抗 4℃孵育 24-48h (3%羊血清稀釋)；恢復(fù)室溫后，PBST 緩慢振搖漂洗 10min x 3；二抗室溫孵育 1 h (避光)，PBST 振搖漂洗 10min x 3；換孵第二種二抗，室溫避光孵育 1 h, PBST 振搖漂洗 10mi


本文編號(hào)：2908435