目的:分離、培養(yǎng)并鑒定飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(Small incision lenticule extraction,SMILE)來(lái)源人眼角膜成纖維細(xì)胞。探究體外機(jī)械性壓力(Mechanical compression)不同加載強(qiáng)度及加載時(shí)間對(duì)人眼角膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖與凋亡、基質(zhì)合成與降解等生命活動(dòng)中相關(guān)分子表達(dá)水平的影響。方法:SMILE手術(shù)獲取人角膜基質(zhì)透鏡,I型膠原酶(Collagenase I)消化、體外分離培養(yǎng)人眼角膜成纖維細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞波形蛋白(Vimentin)表達(dá)以鑒定細(xì)胞類型。建立體外細(xì)胞機(jī)械性壓力刺激模型,對(duì)人眼角膜成纖維細(xì)胞給予不同壓力梯度(Agar+0g、Agar+1g、Agar+2g、Agar+4g、Agar+8g、Agar+16g、Agar+24g、Agar+32g),不同加載時(shí)長(zhǎng)(6h、24h、48h)的機(jī)械性壓力刺激。倒置顯微鏡觀察人眼角膜成纖維細(xì)胞在不同機(jī)械性壓力刺激下形態(tài)學(xué)的變化。免疫熒光BrdU染色比較人眼角膜成纖維細(xì)胞在不同機(jī)械性壓力刺激前后增殖水平的變化。免疫熒光Annexin V/PI染色比較人眼角膜成纖維細(xì)胞在不同機(jī)械性壓力刺激下細(xì)胞凋亡水平的變化。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)合成和降解相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平,檢測(cè)主要指標(biāo)包括:基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員MMP1、MMP9,其拮抗蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成員TIMP1、TIMP2、TIMP3,角膜結(jié)構(gòu)性蛋白相關(guān)基因α1-1型膠原(Collagen type I alpha 1 chain,Col1a1)、光蛋白聚糖(Lumican)、Vimentin等。結(jié)果:1、通過(guò)膠原酶消化法可從SMILE手術(shù)來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡組織中快速獲得并培養(yǎng)人眼角膜成纖維細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形,符合角膜成纖維細(xì)胞特性,免疫組織熒光染色Vimentin表達(dá)陽(yáng)性,明確體外培養(yǎng)所獲得細(xì)胞為角膜成纖維細(xì)胞,無(wú)角膜上皮細(xì)胞及角膜內(nèi)皮細(xì)胞等污染。2、成功建立機(jī)械性壓力刺激模型,并對(duì)人眼角膜成纖維細(xì)胞施加梯度機(jī)械性壓力刺激,觀察顯示相對(duì)低加載強(qiáng)度、相對(duì)短加載時(shí)間條件下的細(xì)胞仍可維持其固有形態(tài)特征,隨壓力加載強(qiáng)度增大和加載時(shí)間延長(zhǎng),Agar+32g組刺激6h、Agar+16g組刺激48h、Agar+24g組刺激48h細(xì)胞出現(xiàn)顯著形態(tài)改變,細(xì)胞形體變大,胞質(zhì)突起變短變粗,細(xì)胞核變大,部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)核固縮。3、免疫熒光BrdU染色結(jié)果顯示,機(jī)械性壓力加載8h后空白對(duì)照組(CON組)與Agar+0g組細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例無(wú)顯著差異,Agar+8g組細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例較CON組顯著降低,說(shuō)明機(jī)械性壓力刺激可顯著抑制人眼角膜成纖維細(xì)胞增殖。免疫熒光Annexin V/PI染色結(jié)果顯示,機(jī)械性壓力加載8h后Agar+8g組較CON組細(xì)胞的Annexin V染色陽(yáng)性細(xì)胞比例升高,PI染色陽(yáng)性細(xì)胞比例升高,說(shuō)明機(jī)械性壓力刺激可促進(jìn)人眼角膜成纖維細(xì)胞凋亡。4、qRT-PCR檢測(cè)角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)分子mRNA結(jié)果顯示,機(jī)械性壓力刺激6h時(shí)MMP1、MMP9的基因表達(dá)顯著升高,TIMP1、Lumican表達(dá)輕度升高,TIMP3表達(dá)顯著降低,余基因表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。機(jī)械性壓力刺激24h時(shí),MMP1出現(xiàn)隨壓力梯度增長(zhǎng)表達(dá)量上調(diào)的趨勢(shì),Col1a1則出現(xiàn)隨壓力梯度增長(zhǎng)表達(dá)量下調(diào)的相反趨勢(shì),MMP9仍在多個(gè)壓力組中有明顯升高,余基因表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。機(jī)械性壓力刺激48h時(shí),MMP1仍可見(jiàn)表達(dá)量上調(diào),此外Col1a1、Vimentin、Lumican等角膜結(jié)構(gòu)性蛋白mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào),余基因表達(dá)未見(jiàn)明顯差異,說(shuō)明機(jī)械壓力會(huì)對(duì)角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)影響。結(jié)論:1、通過(guò)SMILE手術(shù)來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡組織加以膠原酶消化以培養(yǎng)細(xì)胞,是獲得充足、純化的正常原代人眼角膜成纖維細(xì)胞的有效方式。2、對(duì)人眼角膜成纖維細(xì)胞施加梯度機(jī)械性壓力刺激,隨壓力加載強(qiáng)度增大和加載時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞將失去其固有形態(tài)特征。3、人眼角膜成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡明顯會(huì)受到機(jī)械性壓力刺激的影響。4、機(jī)械性壓力短時(shí)間加載可促進(jìn)人眼角膜成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員MMP1、MMP9的表達(dá),長(zhǎng)時(shí)間加載可抑制角膜結(jié)構(gòu)性蛋白Col1a1、Lumican、Vimentin的表達(dá),進(jìn)而參與影響人角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R77
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文原代培養(yǎng)第 1 天，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)角膜成纖維細(xì)胞已貼壁，約半數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，半數(shù)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，中央有卵圓形細(xì)胞核（圖 1.1-A）；原代培養(yǎng)第 3 天，所有細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)呈放射狀（圖 1.1-B）；原代培養(yǎng)第 5 天，可見(jiàn)細(xì)胞進(jìn)一步倍增，生長(zhǎng)密度達(dá) 90%以上，達(dá)到傳代培養(yǎng)所需密度（圖 1.1-C）。

成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況養(yǎng)第 1 天，細(xì)胞已貼壁，呈長(zhǎng)梭形（黑色箭頭）或橢圓形（，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形，放射狀生長(zhǎng)；C：原代培 90%以上。（標(biāo)尺=100μm）纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定至第 5 代，Vimentin 免疫熒光染色，胞漿中可見(jiàn)紅色所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為角膜成纖維細(xì)胞（圖 1.2）。

機(jī)械性壓力施加示意圖；C：12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板加壓后實(shí)物圖2.1.2.2 倒置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞施加機(jī)械性壓力前，在培養(yǎng)板每孔中央?yún)^(qū)域記號(hào)筆標(biāo)記固定位點(diǎn)，倒置顯微鏡下觀察并拍照。待細(xì)胞機(jī)械性壓力刺激實(shí)驗(yàn)所需時(shí)長(zhǎng)后，用無(wú)菌鑷取出施重砝碼、施重玻片和瓊脂凝膠墊，于倒置顯微鏡下觀察標(biāo)記位置細(xì)胞形態(tài)，比較刺激前后同一位置細(xì)胞形態(tài)的變化情況。2.1.2.3 總 RNA 提取細(xì)胞觀察結(jié)束后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 緩沖液沖洗死細(xì)胞 2 次，加入 500μl/孔 Trizol 裂解細(xì)胞，回收至 1.5mlEP 管后，搖床上搖動(dòng) 5min 以充分裂解細(xì)胞使核蛋白體完全分解。加入 100μl/管氯仿抽提 RNA，震蕩 15s，靜置 15min
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