背景下咽癌是一類原發(fā)于下咽部的惡性腫瘤,病理類型以鱗狀細(xì)胞癌為主。其發(fā)生與過量酗酒以及吸煙有密切關(guān)聯(lián)。下咽癌是頭頸外科手術(shù)中處理最為棘手的一種腫瘤。其早期沒有特異性癥狀,一旦發(fā)現(xiàn)多為進(jìn)展期腫瘤。下咽癌易影響上消化呼吸道的生理功能,組織學(xué)上缺乏天然的生物學(xué)屏障,淋巴引流豐富,容易發(fā)生重復(fù)癌,這導(dǎo)致下咽癌治療難度大,容易復(fù)發(fā),是頭頸鱗癌中治療難度較大的一種類型。盡管目前對下咽癌的治療已經(jīng)形成了手術(shù)加放化療綜合治療的共識,治療手段己經(jīng)有極大豐富,下咽癌的整體治療效果仍然不容樂觀。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是下咽治療所面臨的挑戰(zhàn)。腫瘤的個(gè)體化治療是當(dāng)前腫瘤診治的方向。針對患者的自身情況為患者的設(shè)計(jì)個(gè)性化的治療及隨訪方案是腫瘤診治的原則。對腫瘤的復(fù)發(fā)及早診斷能夠提高治療的有效性,改善預(yù)后。除了傳統(tǒng)的TNM分期系統(tǒng)外,許多分子腫瘤標(biāo)記物被應(yīng)用于下咽癌的預(yù)后診斷,提高了對下咽癌隨訪的效果并增加了對腫瘤生物學(xué)的認(rèn)識。蛋白與基因等目前作為分子標(biāo)記物的弊端是其容易受到環(huán)境中理化因素的影響,酶類,濕度及溫度等諸多因素都可能導(dǎo)致降解或變質(zhì),干擾表達(dá)。對于臨床上常見的儲存標(biāo)本如血制品和石蠟切片等,這些分子的檢出難度較大。miRNA是一種體內(nèi)合成的小分子RNA,人體的發(fā)育調(diào)節(jié),免疫功,各器官疾病以及腫瘤的發(fā)生,發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均有miRNA的參與。miRNA分布廣泛,在組織、血漿甚至體液中均有表達(dá)。其表達(dá)相當(dāng)穩(wěn)定,可以在石蠟組織中長期穩(wěn)定的表達(dá),是一種理想的分子標(biāo)記物。目前對miRNA在下咽癌預(yù)后中的研究缺乏大樣本數(shù)據(jù)的支持,本研究目的在于通過高通量技術(shù)篩選并結(jié)合生存分析模型,在一個(gè)大樣本下咽癌病例中篩選與下咽癌預(yù)后相關(guān)的miRNA,評估其臨床價(jià)值。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其生物功能,并通過預(yù)測尋找其靶基因,探索其調(diào)控機(jī)制,為下咽癌的防控和分子生物研究提供新方向。第一部分下咽癌組織和循環(huán)miRNA表達(dá)譜及miR-4451和miR-200a-3p與下咽癌預(yù)后相關(guān)性的研究目的通過芯片技術(shù)和qPCR篩選下咽癌組織和循環(huán)中差異表達(dá)的miRNA,結(jié)合生存分析篩選與下咽癌預(yù)后相關(guān)的miRNA,并評估其臨床價(jià)值。方法回顧我科2011年1月至2016年1月間的下咽癌患者分為兩組,統(tǒng)計(jì)患者的臨床和流行病學(xué)資料。對2015年7月至2016年1月之間的患者納入下咽癌表達(dá)驗(yàn)證組,收集采集患者的腫瘤組織,粘膜組織和血漿標(biāo)本,用于驗(yàn)證miRNA在腫瘤組織和血漿中的表達(dá)。對2011年1月至2015年6月之間的患者納入下咽癌生存分析組,收集患者的的病理切片,并對患者進(jìn)行生存隨訪,以驗(yàn)證miRNA與下咽癌預(yù)后的相關(guān)性。另收集健康對照者血漿標(biāo)本。提取組織中的miRNA,應(yīng)用Agilent miRNA芯片(ID:070156)高通量的篩選候選miRNA。本研究采用了兩種篩選策略,(1)以腫瘤和粘膜分組,在下咽癌腫瘤組和粘膜組之間通過芯片篩選差異表達(dá)的miRNA;(2)以中位生存期分組,在下咽癌長期生存組和短期生存組的腫瘤組織之間通過芯片篩選差異表達(dá)的miRNA。對篩選出的miRNA,在表達(dá)驗(yàn)證組的40對下咽癌腫瘤和粘膜組織中,通過qPCR檢測其表達(dá)水平,以檢驗(yàn)其在下咽癌中差異表達(dá)。在血漿中通過qPCR檢測miRNA表達(dá)水平,研究其與組織表達(dá)水平的相關(guān)性,并通過對比正常志愿者的血漿miRNA表達(dá)水平,評估及臨床價(jià)值。對經(jīng)驗(yàn)證在下咽癌組織中存在差異表達(dá)的miRNA,通過qPCR的方法,在生存分析組患者的腫瘤切片中檢測其表達(dá)水平。通過Kaplan-Meier生存分析,采用Log-rank檢驗(yàn)不同miRNA表達(dá)組之間生存時(shí)間的差異。結(jié)合患者臨床和流行病學(xué)資料,通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型研究預(yù)后相關(guān)miRNA的風(fēng)險(xiǎn)比和多因素調(diào)整后的風(fēng)險(xiǎn)比,并分析預(yù)后相關(guān)miRNA與患者臨床和流行病學(xué)特征的相關(guān)性。通過Harrel's c-index評估包含預(yù)后miRNA在內(nèi)多個(gè)協(xié)變量的Cox模型的診斷預(yù)測能力,研究miRNA對于預(yù)后的臨床價(jià)值。并嘗試通過構(gòu)建miRNA預(yù)后指數(shù),充分發(fā)揮miRNA對下咽癌預(yù)后診斷的能力。結(jié)果在下咽癌腫瘤組和粘膜組之間,芯片篩選出11個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中腫瘤組中高表達(dá)的有l(wèi)et-7c-5p,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451a和miR-497-5p,低表達(dá)的有miR-106b-5p,miR-3195,miR-424-5p,miR-4443和miR-93-5p。在下咽癌長期生存組和短期生存組的腫瘤組織之間,芯片篩選14個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中短期生存組中高表達(dá)的有miR-4451,miR-3605-5p,miR-3161,miR-30b-5p,miR-200a-3p,miR-7150,miR-378b和miR-5088-5p,低表達(dá)的有miR-200c-3p,miR-429,miR-4688,miR-4701,miR-6808-5p和miR-6813-3p。在40對下咽癌腫瘤和粘膜組織qPCR驗(yàn)證以上候選miRNA,9個(gè)miRNA表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在下咽癌腫瘤組織中低表達(dá)的有miR-126-3p(FC=0.55),miR-195-5p(FC=0.0.71),miR-29c-3p(FC=0.63),miR-451a(FC=0.28)和miR-497-5p(FC=0.49),高表達(dá)的有 miR-106b-5p(FC=1.67),miR-93-5p(FC=1.85),miR-4451(FC=1.91)和miR-200a-3p(FC=1.36)。以上差異表達(dá)的miRNA中只有miR-93-5p的血漿表達(dá)水平于組織表達(dá)相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)為0.516,且其表達(dá)水平高于健康對照者。ROC檢驗(yàn)顯示AUG為0.701(p=0.002),在cut-off值0.143處敏感度為0.625,特異度為0.628,約登指數(shù)為0.997。本研究同時(shí)證實(shí),RNU48是下咽癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)合適的內(nèi)參基因。qPCR檢測上述9個(gè)差異表達(dá)miRNA在生存分析組372例下咽癌患者腫瘤組織中的含量。Log-rank檢驗(yàn)顯示miR-4451和miR-200a-3p表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān),miR-200a-3p低表達(dá)組預(yù)期生存期64.8月(95%CI:59.4-70.1),高表達(dá)組預(yù)期生存期52.8個(gè)月(95%CI:46.8-58.7),miR-4451低表達(dá)組的預(yù)期生存期65.6個(gè)月(95%CI:30.2-71.0),高表達(dá)組的生存期52.2個(gè)月(95%CI:46.3-58.1)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均顯著。miR-200a-3p和miR-4451高表達(dá)組預(yù)后不佳。單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示結(jié)果顯示,miR-200a-3p高表達(dá)組相對低表達(dá)組的風(fēng)險(xiǎn)比為1.51(95%CI:1.09-2.09),而miR-4451高表達(dá)組相對低表達(dá)組的風(fēng)險(xiǎn)比為1.64(95%CI:1.18-2.28)。將T分期,N分期,病理分級和原發(fā)部位作為協(xié)變量做多因素Cox分析,以上風(fēng)險(xiǎn)比被調(diào)整為1.42(95%CI:1.02-1.98)和1.47(95%CI:1.06-2.06),統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均顯著。T4期患者中miR-200a-3p高表達(dá)和miR-4451高表達(dá)的比例顯著增加,N2和N3期患者中miR-200a-3p高表達(dá)比例增加。以miR-4451和miR-200a-3p表達(dá)水平構(gòu)建預(yù)后指數(shù)顯示,兩者共同高表達(dá)使患者風(fēng)險(xiǎn)比增加至1.67(單因素,95%CI:1.19-2.33),1.56(多因素,95%CI:1.11-2.20)。Harrel's C-index顯示Cox模型加入miR-4451和miR-200a-3p后診斷預(yù)測能力有所增加。結(jié)論及意義下咽癌腫瘤組織中,miR-126-3p,miR-195-5p,miR-29c-3p,miR-451 a和miR-497-5p低表達(dá),miR-106b-5p,miR-93-5p,miR-4451和miR-200a-3p高表達(dá)。下咽癌患者血漿中miR-93-5p高表達(dá),可作為診斷指標(biāo)。miR-200a-3p高表達(dá)和miR-4451高表達(dá)與下咽癌患者預(yù)后不佳有關(guān)。該研究為下咽癌預(yù)后的分子診斷提供了新的方向。第二部分miR-4451靶向ABHD5調(diào)控下咽癌FaDu細(xì)胞生物學(xué)行為和脂代謝的研究目的通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證第一部分篩選出的miR-4451和miR-200a-3p對下咽癌FaDu細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步尋找其下游靶基因并予以功能驗(yàn)證,在分子水平和細(xì)胞水平研究miRNA調(diào)控靶基因?qū)ο卵拾┥飳W(xué)行為的影響,闡明其功能機(jī)制。方法以FaDu細(xì)胞為研究對象,通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics和inhibitor干擾細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)水平。通過CCK8實(shí)驗(yàn),Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),觀察不同miRNA表達(dá)水平對下咽癌FaDu細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)合TargetScan數(shù)據(jù)庫,miRWalk數(shù)據(jù)庫和mRNA芯片,篩選潛在的miRNA靶基因,并通過Starbase進(jìn)一步縮小靶基因預(yù)測范圍。通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics干擾miRNA細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平,結(jié)合qPCR和Western blot方法從mRNA和蛋白水平檢測候選靶基因的表達(dá)的改變,進(jìn)一步篩選靶基因。構(gòu)建pmirGLO靶基因3'UTR質(zhì)粒,與mimics共轉(zhuǎn)染Fadu細(xì)胞,以雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因。對于篩選的靶基因,在表達(dá)驗(yàn)證組40對下咽癌腫瘤和粘膜組織中通過qPCR檢測其miRNA水平,研究靶基因與下咽癌表達(dá)的相關(guān)性。在生存分析組的患者中取其中57例患者腫瘤切片行免疫組化染色,半定量檢測其蛋白表達(dá)水平,結(jié)合患者生存數(shù)據(jù)研究其與下咽癌預(yù)后的相關(guān)性。對下咽癌FaDu細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶基因siRNA干擾其表達(dá),通過CCK8實(shí)驗(yàn),Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),觀干擾察靶基因?qū)ο卵拾〧aDu細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。對miRNA的功能做回復(fù)實(shí)驗(yàn),共轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor和靶基因siRNA研究其交互作用對FaDu細(xì)胞遷移和脂代謝的影響。結(jié)果功能實(shí)驗(yàn)表明miR-4451促進(jìn)下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而miR-200a-3p對下咽癌FaDu細(xì)胞增殖無作用。通過生信數(shù)據(jù)庫和miRNA芯片,共篩選ABHD5,SLC37A2和ZNF527為候選靶基因。轉(zhuǎn)染miR-4451 mimics后ABHD5在mRNA和蛋白水平均有低表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染pmirGLO-ABHDwild type和miR-4451mimics,FL/RL顯著下降,證實(shí)ABHD5為miR-4451 的靶基因。qPCR檢測表達(dá)驗(yàn)證組40對組織顯示,腫瘤組織中ABHD5的mRNA表達(dá)水平降低。免疫組化染色結(jié)果結(jié)合生存分析顯示在2012年至2013年的57例下咽癌患者中,低表達(dá)ABHD5預(yù)后差,預(yù)期生存期低表達(dá)組vs高表達(dá)組為41.7月vs 64.8月。轉(zhuǎn)染AHBD5 siRNA可促進(jìn)促進(jìn)下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染ABHD5 siRNA可回復(fù)miR-445 1inhibitor對細(xì)胞增殖和脂代謝的影響。miR-4451靶向ABHD5促進(jìn)FaDu細(xì)胞遷移作用,同時(shí)伴有腫瘤細(xì)胞脂滴含量增加。結(jié)論及意義miR-4451促進(jìn)下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。miR-4451通過靶向調(diào)控ABHD5影響FaDu細(xì)胞脂代謝和生物學(xué)行為。ABHD5在下咽癌組織中低表達(dá),與下咽癌預(yù)后有關(guān),ABHD5可促進(jìn)下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。該部分研究為深入了解下咽癌生物學(xué)行為和脂代謝異常提供了新的方向。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.63
【部分圖文】：

圖１－１下咽癌腫瘤和粘膜差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ芯片（芯片１）的原Ａ：１０４Ｔ，?Ｂ：１０４Ｍ，?Ｃ：１０５Ｔ，?Ｄ：?１０５Ｍ，?Ｅ：１０７Ｔ?，?Ｆ：１０７Ｍ，?Ｇ：１１

ｍｍ??ｍｍ??圖１－１下咽癌腫瘤和粘膜差異表達(dá)ｍｉＲＮＡ芯片（芯片１）的原始圖片??Ａ：１０４Ｔ，?Ｂ：１０４Ｍ，?Ｃ：１０５Ｔ，?Ｄ：?１０５Ｍ，?Ｅ：１０７Ｔ?，?Ｆ：１０７Ｍ，?Ｇ：１１５Ｔ，?Ｈ：１１５Ｍ??５９??

圖１－６血漿ｍｉＲ－９３－５ｐ表達(dá)的研宄，Ａ：下咽癌患者血漿的ｍｉＲ－９３－５ｐ表高于正常對照者，Ｂ：血漿ｍｉＲ－９３－５ｐ診斷的ＲＯＣ分析。（＊為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異４??
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1 徐新博;下咽癌組織和循環(huán)miRNA表達(dá)譜及miR-4451、miR-200a-3p在預(yù)后和脂代謝調(diào)控中作用的研究[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2871612