發(fā)布時間：2020-10-30 13:13

　　 第一部分:新生SD大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞原代培養(yǎng)及Cav1.3、LaminB1蛋白的表達(dá)目的:建立新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞(MCs)體外培養(yǎng)體系,探討Cav1.3鈣離子通道蛋白、LaminB1核纖層蛋白在原代培養(yǎng)的新生大鼠邊緣細(xì)胞中是否表達(dá)。方法:選用新生Sprague Dawley乳鼠(p0-p3)為實(shí)驗(yàn)對象,斷頭處理后在解剖顯微鏡下分離外側(cè)壁,眼科剪剪切成微小的組織塊,利用酶消化法將細(xì)胞懸液接種在六孔板上。利用含2%胎牛血清的動物上皮培養(yǎng)基培養(yǎng),隔天換液。吹打純化后制成細(xì)胞爬片,采用免疫熒光法檢測上皮細(xì)胞特異性角蛋白CK-18、Cav1.3鈣離子通道蛋白、LaminB1核纖層蛋白的表達(dá)。結(jié)果:倒置光學(xué)顯微鏡下,24小時內(nèi)可見大部分接種的細(xì)胞團(tuán)塊貼壁良好。培養(yǎng)第4-5天時,多角形的邊緣細(xì)胞和梭形的成纖維細(xì)胞混合生長。MCs呈多角形,大小不一,顏色較暗,界限清楚,細(xì)胞之間連接緊密,形成典型的鋪路石樣外觀。7-9天時,數(shù)百個多角形的邊緣細(xì)胞以及周圍的液體區(qū)域形成“dome”結(jié)構(gòu)。14天后,多角形細(xì)胞體積變大,胞質(zhì)內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多,出現(xiàn)多核或者大核,細(xì)胞骨架明顯,直至崩解。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞角蛋白CK-18、Cav1.3鈣離子通道蛋白、LaminB1核纖層蛋白表達(dá)陽性。結(jié)論:成功建立了新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,為研究邊緣細(xì)胞的生理功能奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了新生大鼠的邊緣細(xì)胞具有表達(dá)Cav1.3鈣離子通道蛋白、LaminB1核纖層蛋白的能力,初步揭示了Cav1.3、LaminB1在耳蝸發(fā)育中扮演一定的角色,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。第二部分:Cav1.3鈣離子通道蛋白在SD大鼠耳蝸組織中的發(fā)育性表達(dá)目的:研究Cav1.3鈣離子通道在新生大鼠耳蝸外側(cè)壁和基底膜發(fā)育過程中的表達(dá)變化,探討其在聽覺生理過程中的作用。方法:取不同發(fā)育時期(0天、7天、14天、21天)SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象。利用免疫熒光組織化學(xué)染色法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)法、實(shí)時定量PCR法檢測Cav1.3在耳蝸外側(cè)壁(血管紋和螺旋韌帶)和基底膜(包括內(nèi)、外毛細(xì)胞)的蛋白以及m RNA水平的表達(dá)含量。結(jié)果:免疫熒光和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)顯示:Cav1.3鈣離子通道在內(nèi)外毛細(xì)胞、血管紋和螺旋韌帶均有表達(dá)。實(shí)時定量PCR法證明Cav1.3鈣離子通道在耳蝸外側(cè)壁和基底膜的表達(dá)隨著發(fā)育逐漸增多。結(jié)論:Cav1.3鈣離子通道在SD大鼠耳蝸中的表達(dá)含量隨發(fā)育逐漸增多。Cav1.3表達(dá)量的上調(diào)可能與耳蝸的發(fā)育、聽力的形成、內(nèi)耳鈣離子的穩(wěn)態(tài)、耳蝸內(nèi)電位(EP)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)以及聽覺功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步闡明Cav1.3鈣離子通道在聽覺系統(tǒng)中的作用提供了理論基礎(chǔ)。第三部分:Lamin B1蛋白在新生大鼠耳蝸中的發(fā)育性表達(dá)及意義目的:Lamin B1是一種有效的調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、神經(jīng)元細(xì)胞遷移和大腦發(fā)育等方面有重要的作用。我們旨在研究出生后大鼠耳蝸的形態(tài)變化和Lamin B1在耳蝸發(fā)育階段的年齡相關(guān)性表達(dá),探討Lamin B1蛋白與耳蝸發(fā)育以及聽覺功能的關(guān)系。方法:使用新生Sprague-Dawley大鼠(p0、p7、p14、p21)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。在顯微鏡下分別解剖分離四個發(fā)育階段的耳蝸膜迷路組織:血管紋(STV,包括螺旋韌帶,下同),基底膜(BM,包括Corti器官,下同)和螺旋神經(jīng)節(jié)(SGC)。采用HE染色和電鏡觀察耳蝸發(fā)育過程中的形態(tài)變化,并且應(yīng)用免疫熒光、實(shí)時定量PCR和免疫印跡技術(shù)從m RNA和蛋白質(zhì)水平檢測Lamin B1在四個發(fā)育階段耳蝸組織中的表達(dá)變化。結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示耳蝸基底膜、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)在出生21天內(nèi)經(jīng)歷了從不成熟到成熟的演變。免疫熒光法證明各發(fā)育階段耳蝸內(nèi)的Lamin B1主要分布于內(nèi)外毛細(xì)胞、K?lliker器官、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋和螺旋韌帶。剛出生時熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值,而后開始減弱,14天時迅速減弱,21天時熒光強(qiáng)度最低。另外,Western blot和RT-PCR結(jié)果證明Lamin B1的蛋白和m RNA在耳蝸組織(外側(cè)壁、螺旋神經(jīng)節(jié)、基底膜)中的相對表達(dá)量,隨著發(fā)育均逐漸減少。結(jié)論:耳蝸在發(fā)育過程中經(jīng)歷了許多典型的形態(tài)學(xué)改變。Lamin B1在耳蝸組織中的表達(dá)含量也隨著發(fā)育逐漸變化,與聽覺形成的時間匹配。表明Lamin B1可能通過調(diào)節(jié)耳蝸結(jié)構(gòu)的發(fā)育促進(jìn)了聽覺功能的發(fā)育和形成。另外,Lamin B1和Cav1.3在耳蝸中的分布相似,而且在發(fā)育過程中都發(fā)生了調(diào)節(jié)性變化,提示兩種蛋白在耳蝸中有相似的作用,兩者均參與了聽覺發(fā)育及形成機(jī)制,也進(jìn)一步證明了Lamin B1在耳蝸中也扮演重要的角色。第四部分:核纖層蛋白Lamin B1在大鼠耳蝸中的選擇性表達(dá)及作用目的:Lamin B1是核纖層的重要組成成分,能夠有效調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Lamin B1在大鼠耳蝸不同組織中的表達(dá)差異并探討其與聽覺功能的關(guān)系。方法:以不同發(fā)育階段(p0、p7、p14、p21)的SD大鼠為研究對象。應(yīng)用免疫熒光法檢測Lamin B1在大鼠耳蝸不同組織中的分布差異,采用Western blot和實(shí)時定量PCR檢測在整個發(fā)育階段,Lamin B1蛋白和m RNA在耳蝸基底膜(BM,包括Corti器官,下同)、螺旋神經(jīng)節(jié)(SGC)和血管紋(STV,包括螺旋韌帶,下同)中的表達(dá)變化。結(jié)果:免疫熒光染色顯示Lamin B1主要分布于毛細(xì)胞(HCs)、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋、螺旋韌帶(SL,spiral ligament)、前庭膜(RM)和螺旋緣(LLS)。出生0-14天,Lamin B1基因的m RNA在不同耳蝸組織之間的表達(dá)沒有差異。出生14天時,Lamin B1蛋白水平在螺旋神經(jīng)節(jié)和基底膜中的表達(dá)比血管紋和螺旋韌帶多,但是螺旋神經(jīng)節(jié)和基底膜的Lamin B1表達(dá)含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot和PCR結(jié)果均表明出生21天時Lamin B1在大鼠耳蝸中的分布具有組織特異性,螺旋神經(jīng)節(jié)最多,基底膜次之,而缺乏神經(jīng)細(xì)胞的血管紋與前兩者相比則表達(dá)量較少。結(jié)論:初步揭示了Lamin B1在發(fā)育時期不同耳蝸組織中的表達(dá)模式,指出Lamin B1在成年大鼠耳蝸組織中的表達(dá)具有組織特異性,可能與聽神經(jīng)細(xì)胞和聽覺的發(fā)育及功能的發(fā)揮有密切的關(guān)系。另外,Lamin B1耳蝸中的選擇性表達(dá)模式和Cav1.3相同,進(jìn)一步證明了Lamin B1在耳蝸中與關(guān)鍵離子通道蛋白有一定關(guān)系,并在聽覺發(fā)育及形成機(jī)制中具有重要作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R764
【部分圖文】：

至3天六孔板中的細(xì)胞數(shù)目增長較慢。培養(yǎng)第四天，多角形的邊緣細(xì)胞(MCs)和梭形的成纖維細(xì)胞混合生長。MCs呈多角形，大小不一，顏色較暗，界限清楚。細(xì)胞之間連接緊密，單層極性排列，形成典型的鋪路石樣外觀（圖.1A）。7-9天時，數(shù)百個多角形的邊緣細(xì)胞以及周圍的液體區(qū)域形成“dome”結(jié)構(gòu)（圖.1B），說明邊緣細(xì)胞具有分泌功能，此時MCs分布在不同的層面。第14天后，多角形細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)空泡越來越多，呈“泡沫樣”外觀，胞質(zhì)內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多，出現(xiàn)多核或者大核，細(xì)胞骨架明顯，直至崩解。此時，長梭形的成纖維細(xì)胞增多，擠占了邊緣細(xì)胞的生長空間。圖.1原代培養(yǎng)的新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 A: 第4-5天時，邊緣細(xì)胞為不規(guī)則的多角形

16細(xì)胞中，而血管紋中只有邊緣細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞，所以，多角形細(xì)胞為邊緣細(xì)胞。圖.2 原代培養(yǎng)的新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞的化學(xué)鑒定 A:細(xì)胞角蛋白CK-18在胞質(zhì)中表達(dá)陽性，呈紅色熒光； B:胞核用DAPI染色，呈藍(lán)色熒光（三）Cav1.3鈣離子通道在MCs中的表達(dá)通過免疫熒光的方法(圖.3-4)，我們首次觀察了Cav1.3在原代培養(yǎng)的新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞中的表達(dá)。(圖.3)我們用紅色熒光來標(biāo)記MCs的角細(xì)胞蛋白CK-18，綠色熒光標(biāo)記目的蛋白Cav1.3，進(jìn)行雙染；(圖.4) 我們用綠色熒光標(biāo)記目的蛋白Cav1.3進(jìn)行單染。通過觀察發(fā)現(xiàn)，Cav1.3鈣離子通道主要表達(dá)在邊緣細(xì)胞胞質(zhì)中。圖.3 Cav1.3鈣離子通道在原代培養(yǎng)新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞的表達(dá)(免疫熒光)。細(xì)胞核DAPI染色后顯示藍(lán)色熒光；細(xì)胞角蛋白CK-18在邊緣細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)陽性，呈現(xiàn)紅色熒光；綠色熒光顯示的是Cav1.3鈣離

圖.2 原代培養(yǎng)的新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞的化學(xué)鑒定 A:細(xì)胞角蛋白CK-18在胞質(zhì)中表達(dá)陽性，呈紅色熒光； B:胞核用DAPI染色，呈藍(lán)色熒光（三）Cav1.3鈣離子通道在MCs中的表達(dá)通過免疫熒光的方法(圖.3-4)，我們首次觀察了Cav1.3在原代培養(yǎng)的新生大鼠血管紋邊緣細(xì)胞中的表達(dá)。(圖.3)我們用紅色熒光來標(biāo)記MCs的角細(xì)胞蛋白CK-18，綠色熒光標(biāo)記目的蛋白Cav1.3，進(jìn)行雙染；(圖.4) 我們用綠色熒光標(biāo)記目的蛋白Cav1.3進(jìn)行單染。通過觀察發(fā)現(xiàn)，Cav1.3鈣離子通道主要表達(dá)在邊緣細(xì)胞胞質(zhì)中。
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本文編號：2862522