第一部分CRISPR-Cas9技術構建LCA-Nmnatl小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究背景：遺傳性疾病是出生缺陷的重要原因,單純性眼科遺傳病近300種,其中先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis, LCA)是發(fā)生最早、最嚴重的遺傳性視網(wǎng)膜病變。目前已發(fā)現(xiàn)18種與LCA相關的致病基因,我們課題組運用外顯子組捕獲和新一代高通量測序的方法,發(fā)現(xiàn)NMNAT1基因突變可以導致第9型先天性黑蒙癥。但是具體的突變致病機制未知。方法：從生物信息學分析、細胞學分析以及CRISPR-Cas9構建定點突變小鼠動物模型三方面探究突變可能的致病機理。生物信息學分析包括人和小鼠NMNAT1蛋白同源性分析,確保以小鼠作為動物模型的可信性；蛋白晶體結(jié)構分析,找到最可能影響蛋白結(jié)構的位點作為突變研究對象；蛋白質(zhì)相互作用分析,探索與NMNAT1相互作用的蛋白。細胞學分析方面構建8種突變和一種野生型重組質(zhì)粒,進行熒光共聚焦和熒光定量實驗,探究突變對亞細胞定位和對RNA水平的影響,后續(xù)將進一步進行蛋白質(zhì)水平的Western Blot實驗。CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型方面,已獲得用于顯微注射的gRNA、Cas9 mRNA和模板DNA,已購買和飼養(yǎng)供體鼠(C57)和受體鼠(ICR),獲得動物模型后將從表型、生化分析、細胞分子水平等方面全面探索致病機制,并且探尋可行的治療方法。結(jié)果：人和小鼠NMNAT1蛋白質(zhì)高度同源。蛋白晶體結(jié)構分析纈氨酸151(V151)位于蛋白的疏水核心,纈氨酸98(V98)接近配體結(jié)合位點,Trp85* (M255)以及Trp169* (M507)無義突變蛋白明顯截短,結(jié)構分散。蛋白質(zhì)相互作用預測其與多種蛋白存在可能的相互作用。熒光共聚焦實驗結(jié)果顯示Trp85*亞細胞定位有明顯逸散出細胞核的現(xiàn)象,其他突變亞細胞定位無異常。熒光定量實驗顯示Trp85*(M255)、Trp169* (M507)無義突變體以及Met35Thr (M104)、Leu153Val(M457)錯義突變體RNA水平和野生型差別不大,而Val151Phe(M451)錯義突變體RNA水平顯著下降。CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型方面,已經(jīng)準備好注射用的RNA和模板DNA。結(jié)論：本研究擬從生物信息學、細胞生物學、分子生物學、生物化學、組織和器官等多角度闡明NMNAT1突變和先天性黑蒙癥的關系。目前進展順利,已完成前期工作,包括生物信息學分析,細胞生物學的部分分析和CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型前面部分,后續(xù)將進一步探究突變的致病機制,以及利用藥物治療和基因治療手段研究治療先天性黑蒙癥的可行性,為臨床研究和治療奠定理論基礎。第二部分PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病(MIM#307800),是一種遺傳性骨病。主要表現(xiàn)為腎小管對磷酸鹽的重吸收異常、發(fā)育遲緩、身材矮小、骨骼疼痛、牙釉質(zhì)異常、雙下肢畸形、行走無力,X射線提示佝僂病癥狀。該病是由位于X染色體p22.1-22.2上PHEX基因突變造成。在本研究中,我們診斷出一個患病男孩,其PHEX基因看似雜合,我們擬探尋具體的致病機制。雖然患者是一名男孩,Sanger測序顯示其X染色體上的PHEX基因有表象上雜合突變,存在雙峰,一個是正常的堿基“G”,另一個是“A”。TA克隆測序表明確實存在這兩種堿基,并且獲得了大致的比率。之后我們用生物信息學工具預測以及外顯子捕獲技術實驗驗證該剪切位點突變對RNA剪切的影響。熒光定量PCR實驗用以檢測PHEx的基因拷貝數(shù)。TA克隆測序?qū)嶒烇@示正常堿基G和突變堿基A的頻率比為19：13。染色體核型分析結(jié)果顯示病人核型正常,熒光定量PCR檢測基因拷貝數(shù)的結(jié)果驗證了核型分析的結(jié)果。這個剪切突變將會引起外顯子18中4個堿基丟失,造成移碼突變,蛋白截短,PHEX蛋白的激活位點和Zn2+結(jié)合位點喪失,因此造成腎小管重吸收障礙和骨骼礦化異常�？傊�,發(fā)生在保守剪切位點的突變將會造成異常的剪切,形成功能受損的蛋白。我們發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變是一個嵌合突變,可能發(fā)生于前期受精卵階段。本研究對于之后進行X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病的遺傳咨詢時考慮嵌合突變起到重要的提示作用。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R-332;R774.1
【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
第一部分 CRISPR-Cas9技術構建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究
    1 引言
    2 材料和方法
    3 結(jié)果
    4 討論與小結(jié)
    5 參考文獻
第二部分 PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病
    1 引言
    2 材料和方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
    6 參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡介及在讀期間所取得的科研成果

【參考文獻】

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1 魯肅;;精準醫(yī)療計劃:機遇與挑戰(zhàn)[J];世界科學;2015年03期

2 徐鵬輝;;美國啟動精準醫(yī)療計劃[J];世界復合醫(yī)學;2015年01期

本文編號：2862451