目的探討玻璃體腔注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(neuronal stem cells,NSCs)及抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)單克隆抗體ranibizumab對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,比較兩種注射藥物的療效差異,探討h UCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的可能機(jī)制,為早期防治DR新的方案的提出提供理論依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠63只,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組(A組,13只)及糖尿病造模組(50只)。糖尿病組經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)糖尿病模型,正常對照組大鼠腹腔注射等容量0.1mol/L枸櫞酸緩沖液。建模4、10周時,進(jìn)行閃光視網(wǎng)膜電圖(flash electroretinogram,F-ERG)國際標(biāo)準(zhǔn)暗適應(yīng)視桿細(xì)胞反應(yīng)(rodresponse,Rod-R)、暗適應(yīng)最大反應(yīng)(maximum response,Max-R)及暗適應(yīng)震蕩電位(oscillatory potentials,OPs)三項(xiàng)基本反應(yīng)的檢測,每只眼記錄3次取平均值,蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察不同造模時間點(diǎn)視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。證實(shí)模型成功后,將糖尿病組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為糖尿病對照組(B組),玻璃體腔內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)組(C組),h UCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs組(D組),ranibizumab組(E組),每組各9只大鼠,A、B組不進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)后2、4、6周分別記錄各組大鼠F-ERG國際標(biāo)準(zhǔn)三項(xiàng)暗適應(yīng)基本反應(yīng),每只眼記錄3次取平均值,干預(yù)后2、4、6周光學(xué)顯微鏡下觀察不同處理時間點(diǎn)視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.F-ERG對造模前后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能變化的檢測:各組大鼠實(shí)驗(yàn)前暗適應(yīng)Rod-R的b波潛伏期及振幅、暗適應(yīng)Max-R的a、b波潛伏期及振幅及暗適應(yīng)OPs總振幅值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。造模后4周,A組與糖尿病組比較僅OPs總振幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。造模后10周,A組與糖尿病造模組比較,Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs的總振幅差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);造模成功分組后A組與B、C、D、E組比較,Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs的總振幅差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05);而B、C、D、E組間F-ERG各波比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。2.F-ERG對干預(yù)后各組大鼠視網(wǎng)膜功能變化的檢測:干預(yù)后2、4周,D、E組Rod、Max-R的b波振幅及OPs總振幅較B、C組顯著性增加(P均0.05),Max-R的b波潛伏期較B、C組顯著性下降(P均0.05);D、E組間,僅OPs總振幅差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。干預(yù)后6周,D組Rod、Max-R的a波、b波振幅及OPs總振幅較B、C、E組顯著性增加(P均0.05),Rod、Max-R的b波潛伏期較B、C、E組顯著性下降(P均0.05),且隨著時間延長上述指標(biāo)均逐漸趨向正常;而E組與B、C組相比,F-ERG各反應(yīng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。分別對5個實(shí)驗(yàn)組干預(yù)前、干預(yù)后2、4、6周4個時間進(jìn)行組內(nèi)比較,A組4個時間點(diǎn)各反應(yīng)波比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。B、C組僅OPs總振幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且均隨著時間的推移OPs總振幅呈下降趨勢。D組Max-R的b波潛伏期、振幅及OPs總振幅4個時間點(diǎn)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Max-R的b波潛伏期隨著時間的推移呈下降趨勢,而b波振幅及OPs總振幅呈升高趨勢。E組Rod-R的b波振幅、Max-R的a波振幅、Max-R的b波振幅、OPs總振幅4個時間點(diǎn)有顯著性差異(P0.05),且隨著時間的推移4個指標(biāo)均呈先上升后下降的趨勢。3.HE染色:造模后4周,A組和糖尿病組比較,視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)未見明顯差異;造模后10周,A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞內(nèi)界膜(internal limiting membrane,ILM)完整清晰,而糖尿病組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞數(shù)量減少且排布紊亂;干預(yù)后2周,A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞鏡下排布整齊,細(xì)胞ILM完整清晰;B、C組較A組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞數(shù)量減少且排布紊亂,ILM連續(xù)性破壞并出現(xiàn)局部增厚的現(xiàn)象;D、E組和B、C組組織結(jié)構(gòu)無明顯差異。4周時,B、C組視網(wǎng)膜較2周時各層細(xì)胞更加不規(guī)則,數(shù)量逐漸減少,ILM的連續(xù)性進(jìn)一步破壞、局部增厚的范圍也加大,甚至可見視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;D、E組各層細(xì)胞排列同樣不規(guī)則,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cel,RGCs)的數(shù)量較B、C組增多,血管擴(kuò)張情況不明顯。6周時,B、C、E組較D組RGCs數(shù)量減少,細(xì)胞核深染,神經(jīng)纖維層(Nerve fiber layer,NFL)變薄且水腫明顯;內(nèi)核層(inner nuclear layer,INL)變薄且結(jié)構(gòu)紊亂;外核層(outer nuclear layer,ONL)排列較亂,ILM完整性破壞更加嚴(yán)重。結(jié)論1.玻璃體腔注射h UCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs及ranibizumab對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能均有改善作用,其中玻璃體腔注射h UCMSCs體外誘導(dǎo)的NSCs效果更佳。2.早期DR引起RGCs、周細(xì)胞等各層細(xì)胞的調(diào)亡要晚于視網(wǎng)膜功能的變化,干預(yù)后視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善晚于視網(wǎng)膜功能的改善。3.早期DR對F-ERG的b波反應(yīng)的影響大于對a波反應(yīng)的影響,振幅對視網(wǎng)膜功能變化的敏感度大于潛伏期。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R587.2;R774.1
【部分圖文】：

圖 1 大鼠 F-ERG 檢測電極放置 圖 2 大鼠 F-ERG 檢測圖2.4 玻璃體腔注射F-ERG 證實(shí) DR 模型建立成功后，采用高壓蒸汽法對微量進(jìn)樣器（10μl，如圖 3）滅菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的劑量腹腔注射，麻醉滿意后，滴加復(fù)方托吡卡胺給予散瞳并使用愛爾卡因滴眼液對大鼠眼球麻醉。微量注射器緩慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs 2μl，避免吸入空氣。在手術(shù)顯微鏡下逐漸將微量進(jìn)樣器針頭通過鞏膜，于大鼠顳側(cè)角膜緣后 2mm 穿過睫狀體平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃體腔內(nèi)，避免刺傷晶狀體（圖 4），緩慢推注hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs，推注完成后為防止液體返流，需在拔針前停頓約15 秒，并用棉簽輕壓進(jìn)針點(diǎn) 1 分鐘，以防注射液返流。操作完成后，需紅霉素及迪可羅眼膏涂抹于結(jié)膜囊。C、E 組大鼠使用同樣的方法分別注射 0.1M PBS 和 10 mg/ml 的 ranibizuma2μl。連續(xù) 3 天觀察操作后大鼠眼部狀況，并用紅霉素眼膏、迪可羅眼膏點(diǎn)眼。發(fā)生玻璃體積血者不納為實(shí)驗(yàn)對象。

8圖 1 大鼠 F-ERG 檢測電極放置 圖 2 大鼠 F-ERG 檢測圖2.4 玻璃體腔注射F-ERG 證實(shí) DR 模型建立成功后，采用高壓蒸汽法對微量進(jìn)樣器（10μl，如圖 3）滅菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的劑量腹腔注射，麻醉滿意后，滴加復(fù)方托吡卡胺給予散瞳并使用愛爾卡因滴眼液對大鼠眼球麻醉。微量注射器緩慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs 2μl，避免吸入空氣。在手術(shù)顯微鏡下逐漸將微量進(jìn)樣器針頭通過鞏膜，于大鼠顳側(cè)角膜緣后 2mm 穿過睫狀體平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃體腔內(nèi)，避免刺傷晶狀體（圖 4），緩慢推注hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs，推注完成后為防止液體返流，需在拔針前停頓約15 秒

圖 1 大鼠 F-ERG 檢測電極放置 圖 2 大鼠 F-ERG 檢測圖2.4 玻璃體腔注射F-ERG 證實(shí) DR 模型建立成功后，采用高壓蒸汽法對微量進(jìn)樣器（10μl，如圖 3）滅菌。10%水合氯醛按照 3ml/kg 的劑量腹腔注射，麻醉滿意后，滴加復(fù)方托吡卡胺給予散瞳并使用愛爾卡因滴眼液對大鼠眼球麻醉。微量注射器緩慢抽取 2×104/μl 的 hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs 2μl，避免吸入空氣。在手術(shù)顯微鏡下逐漸將微量進(jìn)樣器針頭通過鞏膜，于大鼠顳側(cè)角膜緣后 2mm 穿過睫狀體平坦部后再以 45°斜角刺入大鼠玻璃體腔內(nèi)，避免刺傷晶狀體（圖 4），緩慢推注hUCMSCs 體外誘導(dǎo)的 NSCs，推注完成后為防止液體返流，需在拔針前停頓約15 秒，并用棉簽輕壓進(jìn)針點(diǎn) 1 分鐘，以防注射液返流。操作完成后，需紅霉素及迪可羅眼膏涂抹于結(jié)膜囊。C、E 組大鼠使用同樣的方法分別注射 0.1M PBS 和 10 mg/ml 的 ranibizumab2μl。連續(xù) 3 天觀察操作后大鼠眼部狀況，并用紅霉素眼膏、迪可羅眼膏點(diǎn)眼。發(fā)生玻璃體積血者不納為實(shí)驗(yàn)對象。
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2835191