目的:以飛秒激光脈沖技術(shù)輔助制備的超薄脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)片(Femtosecond laser-Acellular Porcine Cornea Matrix,FS-APCM)為支架,收集人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖為種子細(xì)胞,體外模擬構(gòu)建組織工程生物兔角膜內(nèi)皮層植片,從而探討組織工程角膜內(nèi)皮層構(gòu)建的可行性研究。方法:將成年新西蘭大白兔完整的角膜在無(wú)菌條件下取出后將帶有內(nèi)皮細(xì)胞的后彈力層面完整分離,體外消化、純化后得到兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞(Rabbit corneal endothelial cell,RCECs)后進(jìn)行培養(yǎng)。選用P3-P7代HUMSCs,以5×10~5/cm2接種傳代、重懸,分別加入10%、30%、50%、70%、100%不同濃度HUMSCs調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(human umbilical mesenchymal stem cells condition medium,HUMSCs-CM)培養(yǎng),觀察不同濃度HUMSCs-CM對(duì)RCECs細(xì)胞增殖能力影響。通過(guò)傳統(tǒng)手工剖切技術(shù)和飛秒激光脈沖技術(shù)對(duì)比以尋找和優(yōu)化支架條件,利用飛秒激光脈沖技術(shù)獲得帶有后彈力層的超薄豬角膜基質(zhì)支架(厚度約100μm、直徑約8.5mm),于0.5%SDS溶液中4℃脫細(xì)胞24 h后,獲取FS-APCM。選用70%濃度HUMSCs-CM培養(yǎng)下RCECs的進(jìn)行Dil熒光標(biāo)記追蹤,懸架培養(yǎng)法將RCECs細(xì)胞懸液小心滴加在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的于FS-APCM支架上,倒置顯微鏡下分別在接種后2h,3d,5d,1w分別觀察體外重建后內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果:1.體外RCECs原代培養(yǎng)活性良好。RCECs在體外生長(zhǎng)狀態(tài)良好,6天可基本長(zhǎng)滿皿底形成緊密單層,細(xì)胞大小均一,形態(tài)基本一致,多為近似鵝卵石內(nèi)皮樣形態(tài)。2.70%HUMSCs-CM能夠有效促進(jìn)RCECs體外增殖。RCECs形態(tài)學(xué)及MTT法顯示,在同一作用時(shí)間(24h)、不同濃度梯度(10%CEC-CM、30%HUMSCs-CM、50%HUMSCs-CM、70%HUMSCs-CM、100%HUMSCs-CM)作用下均能促進(jìn)RCECs增殖,其中70%HUMSCs-CM作用最為顯著,P1至P4代具有一致性結(jié)果。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,70%HUMSCs-CM能有效促進(jìn)RCECs細(xì)胞體外增殖。3.與傳統(tǒng)手工剖切支架方式相比,飛秒激光脈沖技術(shù)輔助下超薄脫細(xì)胞豬角膜支架(厚度約100μm、直徑約8.5mm)具有較好的重復(fù)性和可操作性。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)手工環(huán)鉆剖切豬角膜組(T-PC組)角膜厚度最厚,飛秒激光脈沖技術(shù)剖切豬角膜支架組(FS-PC)組織切片十分微薄,類似于一薄片。含水量檢測(cè)結(jié)果顯示NPC組溶脹后含水量最高,T-PC次之,FS-PC組含水量最低。HE染色、DAPI染色及DNA含量檢測(cè)均顯示0.5%SDS脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)脫細(xì)胞徹底無(wú)細(xì)胞殘留。4.體外模擬構(gòu)建人工生物角膜內(nèi)皮植片證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞存活狀態(tài)良好。將RCECs種子細(xì)胞接種于FS-APCM支架后懸架培養(yǎng)1w,茜素紅染色、Dil熒光追蹤觀察顯示,RCECs可在FS-APCM上均可形成連續(xù)的單細(xì)胞層,胞間連接緊密,細(xì)胞計(jì)數(shù)密度大于2000cells/mm~2。結(jié)論:1.70%人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(HUMSCs-CM)能有效刺激兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖,為今后角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)提供一種簡(jiǎn)單、高效的方法;2.飛秒激光脈沖技術(shù)輔助制備的超薄脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架(FS-APCM)能對(duì)角膜基質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)切割,為組織工程支架材料優(yōu)化提供更佳的選擇。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R779.6
【部分圖文】：

圖 2-1 兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。A.顯微鏡下可見(jiàn)環(huán)形剪下角膜緣 B.完整分離出后彈力層 C.撕除的兔角膜后彈力層自然向內(nèi)卷曲 D.細(xì)胞 2h 開(kāi)始貼壁 E.2day 見(jiàn)貼壁的細(xì)胞呈觸角狀F.6day 可見(jiàn)細(xì)胞連接緊密，具有典型的鵝卵石樣形態(tài)(40X)。

第 2 章 人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基促進(jìn)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖圖 2-1 兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。A.顯微鏡下可見(jiàn)環(huán)形剪下角膜緣 B.完整分離出后彈力層 C.撕除的兔角膜后彈力層自然向內(nèi)卷曲 D.細(xì)胞 2h 開(kāi)始貼壁 E.2day 見(jiàn)貼壁的細(xì)胞呈觸角狀F.6day 可見(jiàn)細(xì)胞連接緊密，具有典型的鵝卵石樣形態(tài)(40X)。

2-3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RCECs 表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物 ZO-1、Na+/k+-ATPaseN-caderin、Vimentin、AQP1、CollagenIIIa。 不同濃度梯度調(diào)節(jié)培養(yǎng)基（HUMSCs-CM）對(duì) RCECs 體外響了確定不同濃度梯度的 HUMSCs-CM 是否能夠增強(qiáng) RCECs 的增殖中使用不同濃度梯度的 HUMSCs-CM 體外培養(yǎng) RCEC 后進(jìn)行 MTT隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示 HUMSCs-CM 能夠顯著增強(qiáng) RCECs 體外增胞形態(tài)、生長(zhǎng)活性都有促進(jìn)作用。同時(shí)我們觀察發(fā)現(xiàn)，70%HUMS效果最明顯。為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)論，我們通過(guò) HUMSCs-CM 作用于ECs(P1-P4)均得出一致性結(jié)論。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高揚(yáng);飛秒激光兩種切削模式制作兔角膜內(nèi)皮植片手術(shù)效果的相關(guān)研究[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

本文編號(hào)：2817662