研究背景角膜盲是臨床上最常見的致盲性眼病之一,嚴(yán)重影響患者的視覺質(zhì)量。角膜移植手術(shù)是治療不可逆性角膜盲的最有效治療方法。近年來,隨著角膜移植免疫排斥和免疫耐受機(jī)制的不斷研究,眼科顯微外科技術(shù)的飛速發(fā)展,供體角膜組織保存技術(shù)的不斷完善,使得角膜移植手術(shù)一年成功率高達(dá)90%以上。角膜移植手術(shù)是所有組織器官移植中成功率最高的手術(shù)之一,但是隨著時(shí)間延長(zhǎng),排斥反應(yīng)發(fā)生率可能會(huì)增加,尤其是伴隨角膜新生血管、眼部堿化學(xué)傷、感染性角膜炎、多次角膜移植史等高危因素,這些都可能導(dǎo)致角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生率增加。盡管角膜移植手術(shù)的成功率很高,但是角膜移植免疫排斥依然是角膜移植手術(shù)失敗的主要原因之一。盡管目前已經(jīng)有大量角膜移植免疫排斥機(jī)制研究,但是角膜移植排斥反應(yīng)依然不能完全避免,因此,如何預(yù)防和治療角膜移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受仍然需要進(jìn)一步研究。角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜,涉及多種因素。角膜移植排斥反應(yīng)主要由宿主抗移植物反應(yīng)引起,宿主體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞(antigen presention cells,APC)可以經(jīng)血管網(wǎng)到達(dá)角膜植床,捕捉同種異體抗原后移行引流到下頜淋巴結(jié)和頸部淋巴結(jié),在協(xié)同刺激因子的協(xié)助下,抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞,激活效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞,誘發(fā)間接免疫排斥反應(yīng),這是主要免疫排斥反應(yīng)。另一方面,供體角膜植片來源的APC也可能被宿主抗原激活誘發(fā)直接免疫排斥反應(yīng),這是次要免疫排斥反應(yīng)。因此,APC在角膜移植排斥反應(yīng)中起著重要作用。APC主要包括樹突狀細(xì)胞(dendritic cells)和巨噬細(xì)胞,其中DC是抗原遞呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞,因此調(diào)控DC功能對(duì)于預(yù)防和治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Toll受體(Toll-like receptors, TLRs)廣泛表達(dá)于眼表和DC細(xì)胞中,參與眼表各種炎癥反應(yīng)。其中髓樣分化因子88((myeloid differentiation factor 88, MyD88)是TLRs受體家族中大部分成員接受抗原刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到NF-κB的重要銜接蛋白。研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體2 (Toll-like receptor 2, TLR2)和NF-κB在糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑環(huán)孢霉素A防治大鼠角膜移植免疫排斥中表達(dá)下降。髓樣分化因子88((myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)基因敲出可以促進(jìn)小鼠腎臟移植術(shù)后腎功能恢復(fù)和誘導(dǎo)免疫耐受。因此,我們推測(cè)MyD88依賴性NF-κB通路參與大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng),阻斷TLRs信號(hào)通路下游的MyD88和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)對(duì)于研究如何預(yù)防角膜移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受具有重要意義。根據(jù)前期研究和最新進(jìn)展,我們發(fā)現(xiàn)MyD88依賴性NF-κB通路可能參與大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)。因此我們分別從關(guān)鍵靶點(diǎn)MyD88和NF-κB入手,研究分別下調(diào)眼局部和DC中兩者表達(dá)在大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。這將有利于我們進(jìn)一步明確MyD88依賴性NF-κB通路在防治大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。第一部分.NF-κB抑制劑在大鼠角膜移植免疫排斥中作用機(jī)制研究研究目的探討NF-κB抑制劑在大鼠穿透性角膜移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型40只,隨機(jī)分為四組：Isograft組、Allograft組、Dexamethasone組和PDTC組,術(shù)后第1天開始,Isograft組、Allograft組給予妥布霉素滴眼液,Dexamethasone組給予妥布霉素地塞米松滴眼液,PDTC組給予妥布霉素眼液與10mg/L PDTC滴眼液,1滴／次,4次／天,術(shù)后觀察各組角膜植片排斥反應(yīng),進(jìn)行RI(rejection index)評(píng)分和生存分析(survival analysis),術(shù)后15天行角膜組織HE染色和TNF-a免疫組化,RT-PCR檢測(cè)角膜組織中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA表達(dá),western blotting檢測(cè)角膜組織中TLR2、MyD88和NF-κB P65蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果術(shù)后5、7、9、11、13和15天,Isograft組、Allograft組、PDTC組、Dexamethasone組,四組角膜植片RI比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=257.705, P0.001)。Allgraft組RI高于其余三組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。PDTC組角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)(median survival time, MST)(MST,23days, n=10),Isograft組(MST,19days, n=10), Allograft組(MST,14days, n=10)和Dexamethasone組(MST,25days,n=10),四組間角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=66.491,P0.001)。術(shù)后15天,Dexamethasone組和PDTC組角膜組織中TNF-a表達(dá)較Allograft組顯著減少。術(shù)后15天,Dexamethasone組和PDTC組角膜植片中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯著少于Allograft組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論Dexamethasone可以通過MyD88依賴性NF-κB通路抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng),PDTC可以通過抑制NF-κB活性抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng),MyD88依賴性NF-κB信號(hào)通路可以作為防治大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的重要調(diào)控通路。第二部分.MyD88抑制劑在大鼠角膜移植免疫排斥中作用研究研究目的初步探討MyD88抑制劑在大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型,隨機(jī)分為三組：Allograft組,Dexamethasone組和MyD88抑制劑組,術(shù)后第1d開始,Allograft組給予妥布霉素滴眼液滴術(shù)眼,Dexamethasone組給予妥布霉素地塞米松滴眼液滴術(shù)眼,MyD88抑制劑組給予妥布霉素滴眼液與2mg/ml ST2825滴眼液滴術(shù)眼,1滴/次,4次/日,裂隙燈顯微鏡觀察各組角膜植片排斥反應(yīng),進(jìn)行角膜植片RI評(píng)分和生存分析。結(jié)果術(shù)后5、7、9、11、13和15天,Allograft組,Dexamethasone組和MyD88抑制劑組,三組間RI排斥指數(shù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=91.870,P0.05)。術(shù)后5、7、9、11、13和15天,Dexamethasone組和ST2825組的RI指數(shù)低于Allograft組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ST2825組與Dexamethasone組RI評(píng)分比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.458)。隨著時(shí)間推移,各組角膜植片排斥指數(shù)均不斷增加。Allograft組角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)(median survival time, MST)(MST,13 days, n=6), ST2825組(MST,23 days, n=6)和Dexamethasone組(MST,24 days, n=6)。三組間生存時(shí)間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=24.110,P0.001)。ST2825組和Dexamethasone組角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)高于Allograft組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=12.230,P0.001)。Dexamethasone組角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)高于PDTC組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.360,P=0.124)。結(jié)論MyD88特異性抑制劑ST2825短期內(nèi)局部滴眼未見明顯眼部毒副作用,其具有一定的抑制大鼠角膜移植免疫排斥的作用,可能與抑制角膜組織中MyD88表達(dá)相關(guān)。第三部分.樹突狀細(xì)胞中NF-κB在大鼠角膜移植免疫排斥中作用機(jī)制研究研究目的探討Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染大鼠髓源性DC在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用機(jī)制。研究方法(1).應(yīng)用含5ng/ml粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)與5ng/ml IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)大鼠髓源性DC,流式細(xì)胞儀分析DC表面刺激分子CD86、MHC Ⅱ、OX62表達(dá),混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)其刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力。(2).應(yīng)用高效抑制Rel-A表達(dá)的shRNA序列,構(gòu)建Lv-siRNA-Rel-A載體,Western blotting驗(yàn)證其抑制Rel-A表達(dá)功能。將Lv-siRNA-Rel-A載體轉(zhuǎn)染大鼠DC,應(yīng)用Western blotting檢測(cè)DC中Rel-A蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后DC表型分子CD80、CD86、MHC Ⅱ表達(dá)變化,MLR檢測(cè)其刺激同種T細(xì)胞增殖能力。DC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：A.空白對(duì)照組(細(xì)胞內(nèi)不加任何干擾因素)；B.轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(轉(zhuǎn)染不攜帶siRNA的空RNAi-Mate); C.陰性對(duì)照siRNA組(轉(zhuǎn)染與目的基因序列無同源性的通用陰性對(duì)照,空載體組); D. Rel-A-siRNA組。Western blotting檢測(cè)各組DC中Rel-A蛋白表達(dá)變化。(3).將負(fù)載供體抗原的2×106個(gè)培養(yǎng)第7d的Lv-shRNA-Rel-A DC于術(shù)前7d注入大鼠穿透性角膜移植模型中,實(shí)驗(yàn)分為六組：同種同體組,同種異體組,試劑轉(zhuǎn)染組,DC組,空載體組,治療組。術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察角膜植片排斥情況,進(jìn)行RI評(píng)分,Western blotting和RT-PCR檢測(cè)大鼠角膜組織中TLR2、MyD88、NF-κBP65的蛋白和mRNA表達(dá)變化。結(jié)果(1). RPMI-1640含5ng/ml GM-CSF與5ng/ml IL-4的培養(yǎng)液可以獲得足量大鼠髓源性DC,表達(dá)中等水平MHC Ⅱ和低水平CD86,刺激同種T細(xì)胞增殖能力低。共刺激分子MHC Ⅱ、CD86、OX62三組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=969.213,P0.001)。Day 9、12, DC表面MHC Ⅱ分子表達(dá)高于CD86(P=0.039)和低于OX62(P0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD86表達(dá)低于OX62(P0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MHC Ⅱ、CD86、OX62表達(dá)陽性率隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,說明DC表型不斷成熟,DC純化程度越來越高,抗原遞呈能力不斷增強(qiáng)。(2).2.5×103DC組、5×103DC組、1×104DC組,三組間DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F-23.889,P0.05),其中2.5×103 DC組光吸收度A值低于5x103DC組(P=0.001)和1×104 DC組(P0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,5×103 DC組光吸收度A值低于1×104 DC組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異昨0.008)。培養(yǎng)第12d,DC刺激同種異體T細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。(3).構(gòu)建Lv-siRNA-Rel-A慢病毒載體,RNA干擾組(Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC組)大鼠DC中CD80,CD86的表達(dá)顯著低于DC空載體對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),這說明siRNA-Rel-A可以降低DC表面刺激分子CD80、CD86的表達(dá)。RNA干擾組DC表面MHCⅡ分子表達(dá)下降不顯著(P=0.080)。(4).空白對(duì)照組(A組)、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(B組)、陰性siRNA對(duì)照組(C組)與Rel-A-siRNA組(D組),四組間DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.31,P0.01);LPS刺激DC和Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC后,LPS-siRNA-DC組刺激T細(xì)胞增殖能力較LPS-DC組弱具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。這說明Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC可以降低其刺激同種T細(xì)胞增殖的能力。(5).空白對(duì)照組(A組)、試劑轉(zhuǎn)染組(B組)、空載體組(C組)與siRNA-Rel-A組(D組),四組間Rel-A蛋白表達(dá)比較,siRNA-Rel-A組分別與空載體組和空白對(duì)照組比較,DC中Rel-A蛋白表達(dá)量顯著下降(P0.05)。(6).同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,五組間角膜植片RI評(píng)分經(jīng)球形檢驗(yàn)(Mauchly's Test of Sphericity), W=0.967,x2=0.642,P=0.725,接受球形假設(shè)。術(shù)后5d、10d、15d,五組間RI評(píng)分比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=78.556,P0.05)。治療組RI評(píng)分低于同種異體組(P0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組與同種同體組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.037)。隨著時(shí)間推移,各組角膜植片排斥指數(shù)均不斷增加。(7).術(shù)后15天,正常組、同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,六個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Rel-A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),治療組角膜組織中Rel-A蛋白表達(dá)下降,NF-κB活性下降。(8).正常角膜組織表達(dá)一定量TLR2與MyD88 mRNA。術(shù)后15天,正常組、同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,六組間角膜組織中TLR2mRNA表達(dá)的差異倍數(shù)有顯著性差異(F=27.807,P0.001)。DC組中TLR2mRNA表達(dá)差異倍數(shù)顯著低于同種異體組(P=0.029)。治療組TLR2 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)低于同種異體組(P=0.079)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后15天,六組間角膜組織中MyD88 mRNA表達(dá)的差異倍數(shù)具有顯著性差異(F=85.844,P0.001)。DC組角膜組織中MyD88 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)顯著低于同種異體組(P=0.033)。治療組MyD88 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)低于同種異體組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.044)。結(jié)論DC轉(zhuǎn)染Lv-siRNA-Rel-A可以下調(diào)DC中Rel-A表達(dá),降低DC表面CD80、CD86分子表達(dá),維持未成熟化DC,抑制同種T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC負(fù)載供體抗原后注入大鼠角膜移植體內(nèi),可以下調(diào)角膜組織中TLR2、MyD88、NF-κB(Rel-A)蛋白表達(dá),延緩大鼠角膜移植排斥反應(yīng)。MyD88依賴性NF-κB通路具有一定調(diào)控大鼠角膜移植免疫排斥的作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R779.65
【部分圖文】：

ex為（ＭＳＴ，２３邋（ｋｙｓ，邋ｎ＝１０），邋Ｄｅｘａｍｄｈａｓｏｎｅ組角膜植片生存時(shí)間中位數(shù)為（ＭＳＴ，逡逑２５ｄａｙｓ，ｎ＝１０）。四組間的生存時(shí)間比較，采用Ｌｏｇ民ａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量逡逑比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｘ２二６６．４９１，。（見表３，圖３）逡逑１９逡逑

邐博去學(xué)位論文邐逡逑２．４角膜植片ＴＮＦ－ａ表達(dá)逡逑術(shù)后１５天取材，行ＴＮＦ－ａ免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)，正常角膜組織中無雖著逡逑ＴＮＦ－ａ表達(dá)，Ａｌｌｏｇｒａｆｔ組角膜植片上皮層高度表達(dá)ＴＮＦ－ａ，基質(zhì)層散在表達(dá)，基質(zhì)層逡逑顯著水腫X椇�，伴炎症细胞浸润。ＩｓｅP紓潁幔媯糇椋模澹幔恚澹簦瑁幔螅錚睿遄楹停校模裕米榻悄ゅ義現(xiàn)財(cái)校裕危疲岜澩鏘災(zāi)儆冢粒歟歟錚紓潁幔媯魙D。（見圖４）逡逑．；

圖５．２？各組角膜組織中化Ｒ２，邋ＭｙＤ８８和ｐ６５的ｍＲＮＡ表達(dá)

本文編號(hào)：2811115