研究背景角膜盲是臨床上最常見的致盲性眼病之一,嚴重影響患者的視覺質(zhì)量。角膜移植手術是治療不可逆性角膜盲的最有效治療方法。近年來,隨著角膜移植免疫排斥和免疫耐受機制的不斷研究,眼科顯微外科技術的飛速發(fā)展,供體角膜組織保存技術的不斷完善,使得角膜移植手術一年成功率高達90%以上。角膜移植手術是所有組織器官移植中成功率最高的手術之一,但是隨著時間延長,排斥反應發(fā)生率可能會增加,尤其是伴隨角膜新生血管、眼部堿化學傷、感染性角膜炎、多次角膜移植史等高危因素,這些都可能導致角膜移植排斥反應發(fā)生率增加。盡管角膜移植手術的成功率很高,但是角膜移植免疫排斥依然是角膜移植手術失敗的主要原因之一。盡管目前已經(jīng)有大量角膜移植免疫排斥機制研究,但是角膜移植排斥反應依然不能完全避免,因此,如何預防和治療角膜移植排斥反應和誘導角膜移植免疫耐受仍然需要進一步研究。角膜移植排斥反應發(fā)生機制比較復雜,涉及多種因素。角膜移植排斥反應主要由宿主抗移植物反應引起,宿主體內(nèi)抗原遞呈細胞(antigen presention cells,APC)可以經(jīng)血管網(wǎng)到達角膜植床,捕捉同種異體抗原后移行引流到下頜淋巴結(jié)和頸部淋巴結(jié),在協(xié)同刺激因子的協(xié)助下,抗原遞呈給T淋巴細胞,激活效應性T淋巴細胞,誘發(fā)間接免疫排斥反應,這是主要免疫排斥反應。另一方面,供體角膜植片來源的APC也可能被宿主抗原激活誘發(fā)直接免疫排斥反應,這是次要免疫排斥反應。因此,APC在角膜移植排斥反應中起著重要作用。APC主要包括樹突狀細胞(dendritic cells)和巨噬細胞,其中DC是抗原遞呈功能最強的細胞,因此調(diào)控DC功能對于預防和治療角膜移植免疫排斥反應具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Toll受體(Toll-like receptors, TLRs)廣泛表達于眼表和DC細胞中,參與眼表各種炎癥反應。其中髓樣分化因子88((myeloid differentiation factor 88, MyD88)是TLRs受體家族中大部分成員接受抗原刺激信號轉(zhuǎn)導到NF-κB的重要銜接蛋白。研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體2 (Toll-like receptor 2, TLR2)和NF-κB在糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑環(huán)孢霉素A防治大鼠角膜移植免疫排斥中表達下降。髓樣分化因子88((myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)基因敲出可以促進小鼠腎臟移植術后腎功能恢復和誘導免疫耐受。因此,我們推測MyD88依賴性NF-κB通路參與大鼠角膜移植免疫排斥反應,阻斷TLRs信號通路下游的MyD88和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達對于研究如何預防角膜移植排斥反應和誘導角膜移植免疫耐受具有重要意義。根據(jù)前期研究和最新進展,我們發(fā)現(xiàn)MyD88依賴性NF-κB通路可能參與大鼠角膜移植免疫排斥反應。因此我們分別從關鍵靶點MyD88和NF-κB入手,研究分別下調(diào)眼局部和DC中兩者表達在大鼠角膜移植排斥反應中的作用機制。這將有利于我們進一步明確MyD88依賴性NF-κB通路在防治大鼠角膜移植排斥反應中的作用機制。第一部分.NF-κB抑制劑在大鼠角膜移植免疫排斥中作用機制研究研究目的探討NF-κB抑制劑在大鼠穿透性角膜移植排斥反應中的作用機制。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型40只,隨機分為四組：Isograft組、Allograft組、Dexamethasone組和PDTC組,術后第1天開始,Isograft組、Allograft組給予妥布霉素滴眼液,Dexamethasone組給予妥布霉素地塞米松滴眼液,PDTC組給予妥布霉素眼液與10mg/L PDTC滴眼液,1滴／次,4次／天,術后觀察各組角膜植片排斥反應,進行RI(rejection index)評分和生存分析(survival analysis),術后15天行角膜組織HE染色和TNF-a免疫組化,RT-PCR檢測角膜組織中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA表達,western blotting檢測角膜組織中TLR2、MyD88和NF-κB P65蛋白表達量的變化。結(jié)果術后5、7、9、11、13和15天,Isograft組、Allograft組、PDTC組、Dexamethasone組,四組角膜植片RI比較具有統(tǒng)計學差異(F=257.705, P0.001)。Allgraft組RI高于其余三組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。PDTC組角膜植片生存時間中位數(shù)(median survival time, MST)(MST,23days, n=10),Isograft組(MST,19days, n=10), Allograft組(MST,14days, n=10)和Dexamethasone組(MST,25days,n=10),四組間角膜植片生存時間中位數(shù)比較具有統(tǒng)計學差異(χ2=66.491,P0.001)。術后15天,Dexamethasone組和PDTC組角膜組織中TNF-a表達較Allograft組顯著減少。術后15天,Dexamethasone組和PDTC組角膜植片中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA和蛋白質(zhì)相對表達量顯著少于Allograft組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論Dexamethasone可以通過MyD88依賴性NF-κB通路抑制大鼠角膜移植排斥反應,PDTC可以通過抑制NF-κB活性抑制大鼠角膜移植排斥反應,MyD88依賴性NF-κB信號通路可以作為防治大鼠角膜移植排斥反應的重要調(diào)控通路。第二部分.MyD88抑制劑在大鼠角膜移植免疫排斥中作用研究研究目的初步探討MyD88抑制劑在大鼠角膜移植排斥反應中的作用。研究方法建立大鼠穿透性角膜移植模型,隨機分為三組：Allograft組,Dexamethasone組和MyD88抑制劑組,術后第1d開始,Allograft組給予妥布霉素滴眼液滴術眼,Dexamethasone組給予妥布霉素地塞米松滴眼液滴術眼,MyD88抑制劑組給予妥布霉素滴眼液與2mg/ml ST2825滴眼液滴術眼,1滴/次,4次/日,裂隙燈顯微鏡觀察各組角膜植片排斥反應,進行角膜植片RI評分和生存分析。結(jié)果術后5、7、9、11、13和15天,Allograft組,Dexamethasone組和MyD88抑制劑組,三組間RI排斥指數(shù)比較具有統(tǒng)計學差異(F=91.870,P0.05)。術后5、7、9、11、13和15天,Dexamethasone組和ST2825組的RI指數(shù)低于Allograft組具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。ST2825組與Dexamethasone組RI評分比較無統(tǒng)計學差異(P=0.458)。隨著時間推移,各組角膜植片排斥指數(shù)均不斷增加。Allograft組角膜植片生存時間中位數(shù)(median survival time, MST)(MST,13 days, n=6), ST2825組(MST,23 days, n=6)和Dexamethasone組(MST,24 days, n=6)。三組間生存時間比較具有統(tǒng)計學差異(χ2=24.110,P0.001)。ST2825組和Dexamethasone組角膜植片生存時間中位數(shù)高于Allograft組具有統(tǒng)計學差異(χ2=12.230,P0.001)。Dexamethasone組角膜植片生存時間中位數(shù)高于PDTC組無顯著統(tǒng)計學差異(χ2=2.360,P=0.124)。結(jié)論MyD88特異性抑制劑ST2825短期內(nèi)局部滴眼未見明顯眼部毒副作用,其具有一定的抑制大鼠角膜移植免疫排斥的作用,可能與抑制角膜組織中MyD88表達相關。第三部分.樹突狀細胞中NF-κB在大鼠角膜移植免疫排斥中作用機制研究研究目的探討Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染大鼠髓源性DC在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用機制。研究方法(1).應用含5ng/ml粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與5ng/ml IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液誘導分化培養(yǎng)大鼠髓源性DC,流式細胞儀分析DC表面刺激分子CD86、MHC Ⅱ、OX62表達,混合淋巴細胞反應(MLR)檢測其刺激同種T淋巴細胞增殖能力。(2).應用高效抑制Rel-A表達的shRNA序列,構(gòu)建Lv-siRNA-Rel-A載體,Western blotting驗證其抑制Rel-A表達功能。將Lv-siRNA-Rel-A載體轉(zhuǎn)染大鼠DC,應用Western blotting檢測DC中Rel-A蛋白表達,流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染后DC表型分子CD80、CD86、MHC Ⅱ表達變化,MLR檢測其刺激同種T細胞增殖能力。DC細胞轉(zhuǎn)染后分四個實驗組：A.空白對照組(細胞內(nèi)不加任何干擾因素)；B.轉(zhuǎn)染試劑對照組(轉(zhuǎn)染不攜帶siRNA的空RNAi-Mate); C.陰性對照siRNA組(轉(zhuǎn)染與目的基因序列無同源性的通用陰性對照,空載體組); D. Rel-A-siRNA組。Western blotting檢測各組DC中Rel-A蛋白表達變化。(3).將負載供體抗原的2×106個培養(yǎng)第7d的Lv-shRNA-Rel-A DC于術前7d注入大鼠穿透性角膜移植模型中,實驗分為六組：同種同體組,同種異體組,試劑轉(zhuǎn)染組,DC組,空載體組,治療組。術后裂隙燈顯微鏡觀察角膜植片排斥情況,進行RI評分,Western blotting和RT-PCR檢測大鼠角膜組織中TLR2、MyD88、NF-κBP65的蛋白和mRNA表達變化。結(jié)果(1). RPMI-1640含5ng/ml GM-CSF與5ng/ml IL-4的培養(yǎng)液可以獲得足量大鼠髓源性DC,表達中等水平MHC Ⅱ和低水平CD86,刺激同種T細胞增殖能力低。共刺激分子MHC Ⅱ、CD86、OX62三組間具有統(tǒng)計學差異(F=969.213,P0.001)。Day 9、12, DC表面MHC Ⅱ分子表達高于CD86(P=0.039)和低于OX62(P0.001)具有統(tǒng)計學差異。CD86表達低于OX62(P0.001)具有統(tǒng)計學差異。MHC Ⅱ、CD86、OX62表達陽性率隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增加,說明DC表型不斷成熟,DC純化程度越來越高,抗原遞呈能力不斷增強。(2).2.5×103DC組、5×103DC組、1×104DC組,三組間DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力差異具有統(tǒng)計學意義(F-23.889,P0.05),其中2.5×103 DC組光吸收度A值低于5x103DC組(P=0.001)和1×104 DC組(P0.001)具有統(tǒng)計學差異,5×103 DC組光吸收度A值低于1×104 DC組具有統(tǒng)計學差異昨0.008)。培養(yǎng)第12d,DC刺激同種異體T細胞的增殖能力顯著增強。(3).構(gòu)建Lv-siRNA-Rel-A慢病毒載體,RNA干擾組(Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC組)大鼠DC中CD80,CD86的表達顯著低于DC空載體對照組具有統(tǒng)計學差異(p0.05),這說明siRNA-Rel-A可以降低DC表面刺激分子CD80、CD86的表達。RNA干擾組DC表面MHCⅡ分子表達下降不顯著(P=0.080)。(4).空白對照組(A組)、轉(zhuǎn)染試劑對照組(B組)、陰性siRNA對照組(C組)與Rel-A-siRNA組(D組),四組間DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力差異具有統(tǒng)計學意義(F=105.31,P0.01);LPS刺激DC和Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC后,LPS-siRNA-DC組刺激T細胞增殖能力較LPS-DC組弱具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。這說明Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC可以降低其刺激同種T細胞增殖的能力。(5).空白對照組(A組)、試劑轉(zhuǎn)染組(B組)、空載體組(C組)與siRNA-Rel-A組(D組),四組間Rel-A蛋白表達比較,siRNA-Rel-A組分別與空載體組和空白對照組比較,DC中Rel-A蛋白表達量顯著下降(P0.05)。(6).同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,五組間角膜植片RI評分經(jīng)球形檢驗(Mauchly's Test of Sphericity), W=0.967,x2=0.642,P=0.725,接受球形假設。術后5d、10d、15d,五組間RI評分比較具有統(tǒng)計學差異(F=78.556,P0.05)。治療組RI評分低于同種異體組(P0.05)具有統(tǒng)計學差異。治療組與同種同體組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.037)。隨著時間推移,各組角膜植片排斥指數(shù)均不斷增加。(7).術后15天,正常組、同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,六個實驗組中Rel-A蛋白相對表達量比較具有統(tǒng)計學差異(P0.05),治療組角膜組織中Rel-A蛋白表達下降,NF-κB活性下降。(8).正常角膜組織表達一定量TLR2與MyD88 mRNA。術后15天,正常組、同種同體組、同種異體組、DC組、空載體組與治療組,六組間角膜組織中TLR2mRNA表達的差異倍數(shù)有顯著性差異(F=27.807,P0.001)。DC組中TLR2mRNA表達差異倍數(shù)顯著低于同種異體組(P=0.029)。治療組TLR2 mRNA表達差異倍數(shù)低于同種異體組(P=0.079)無統(tǒng)計學差異。術后15天,六組間角膜組織中MyD88 mRNA表達的差異倍數(shù)具有顯著性差異(F=85.844,P0.001)。DC組角膜組織中MyD88 mRNA表達差異倍數(shù)顯著低于同種異體組(P=0.033)。治療組MyD88 mRNA表達差異倍數(shù)低于同種異體組有統(tǒng)計學差異(P=0.044)。結(jié)論DC轉(zhuǎn)染Lv-siRNA-Rel-A可以下調(diào)DC中Rel-A表達,降低DC表面CD80、CD86分子表達,維持未成熟化DC,抑制同種T淋巴細胞增殖反應。Lv-siRNA-Rel-A轉(zhuǎn)染DC負載供體抗原后注入大鼠角膜移植體內(nèi),可以下調(diào)角膜組織中TLR2、MyD88、NF-κB(Rel-A)蛋白表達,延緩大鼠角膜移植排斥反應。MyD88依賴性NF-κB通路具有一定調(diào)控大鼠角膜移植免疫排斥的作用。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R779.65
【部分圖文】：

ex為（ＭＳＴ，２３邋（ｋｙｓ，邋ｎ＝１０），邋Ｄｅｘａｍｄｈａｓｏｎｅ組角膜植片生存時間中位數(shù)為（ＭＳＴ，逡逑２５ｄａｙｓ，ｎ＝１０）。四組間的生存時間比較，采用Ｌｏｇ民ａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）檢驗統(tǒng)計量逡逑比較具有統(tǒng)計學差異（Ｘ２二６６．４９１，。（見表３，圖３）逡逑１９逡逑

邐博去學位論文邐逡逑２．４角膜植片ＴＮＦ－ａ表達逡逑術后１５天取材，行ＴＮＦ－ａ免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)，正常角膜組織中無雖著逡逑ＴＮＦ－ａ表達，Ａｌｌｏｇｒａｆｔ組角膜植片上皮層高度表達ＴＮＦ－ａ，基質(zhì)層散在表達，基質(zhì)層逡逑顯著水腫X椇�，伴炎症细胞浸润。ＩｓｅP紓潁幔媯糇�，ＤｅｘａｍｅｔｈａｓｅP睿遄楹停校模裕米榻悄ゅ義現(xiàn)財校裕危疲岜澩鏘災儆冢粒歟歟錚紓潁幔媯魙D。（見圖４）逡逑．；

圖５．２？各組角膜組織中化Ｒ２，邋ＭｙＤ８８和ｐ６５的ｍＲＮＡ表達

本文編號：2811115