背景與目的翼狀胬肉是臨床上常見(jiàn)的眼表疾病,是結(jié)膜處增生的良性纖維結(jié)締組織及血管,可發(fā)展到侵及角膜,其病因不明,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該疾病與各種慢性炎癥刺激有關(guān),如紫外線照射、沙塵刺激等引起。其主要的病理機(jī)制是在慢性炎癥刺激下,翼狀胬肉前體細(xì)胞在活化或升高的細(xì)胞因子等作用下發(fā)生細(xì)胞增殖、遷移、祖細(xì)胞上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化、肌成纖維細(xì)胞的激活等。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β 1)是在翼狀胬肉組織中高表達(dá)的一種重要的炎癥因子,被認(rèn)為和翼狀胬肉的形成有關(guān)。翼狀胬肉術(shù)后,創(chuàng)傷過(guò)度修復(fù)造成的病理性纖維化,會(huì)導(dǎo)致翼狀胬肉的復(fù)發(fā)。研究表明,非甾體類抗炎藥(Non-Steroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)能夠減輕炎癥反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、抑制肌成纖維細(xì)胞的激活等纖維化過(guò)程,能有效降低乳腺癌等纖維化疾病的復(fù)發(fā)率。另外,研究發(fā)現(xiàn),對(duì)比于匹配的結(jié)膜組織,環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在翼狀胬肉組織中明顯高表達(dá),COX-2抑制劑在體外模擬實(shí)驗(yàn)中可以有效抑制翼狀胬肉細(xì)胞增殖,但其對(duì)翼狀胬肉細(xì)胞的抗纖維化作用及其分子機(jī)制仍不明確。因此本學(xué)位論文旨在通過(guò)體外培養(yǎng)的人原代翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(human pterygium fibroblasts,HPFs)及人結(jié)膜成纖維細(xì)胞(human conjunctival fibroblasts,HConFs)模型,探究TGF-β1對(duì)HPFs及HConFs的細(xì)胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移及增殖的誘導(dǎo)作用,以及非甾體類抗炎藥溴芬酸鈉(bromfenac)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移及增殖的作用及其可能的機(jī)制。方法首先,將體外培養(yǎng)的HPFs和HConFs細(xì)胞分別分為5組,即20 ng/ml TGF-β1刺激(4組)和無(wú)TGF-β1刺激的對(duì)照組(1組),在TGF-β1刺激6h,12h,24h,48h后,用Western Blot檢測(cè)間充質(zhì)標(biāo)志物纖連蛋白(fibronectin,FN),Ⅲ型膠原蛋白(collagen 3,COL3)以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的蛋白表達(dá)水平,另外,在刺激15min,30min,1 h,2h,6h后,同樣用Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子磷酸化水平及其本底蛋白表達(dá)水平,包括:AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK。為研究溴芬酸鈉對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移及增殖的可能的抑制作用,將HPFs及HConFs細(xì)胞分別分成4組,即:對(duì)照組;20 ng/ml TGF-β 1處理組;20 ng/ml TGF-β 1+90ug/ml溴芬酸鈉同時(shí)處理組;90ug/ml溴芬酸鈉處理組。各組HPFs及HConFs細(xì)胞同時(shí)處理48h,然后用Western Blot及免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞FN,COL3和α-SMA蛋白表達(dá)水平及分布的改變,同樣用Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子的改變,用劃線實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。為進(jìn)一步證明單用溴芬酸鈉可能的抑制細(xì)胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移及增殖的相關(guān)標(biāo)志物的作用,用3種不同濃度溴芬酸鈉(即:30ug/ml,60ug/ml,90ug/ml)梯度處理HPFs和HConFs細(xì)胞,處理48h后對(duì)比無(wú)溴芬酸鈉刺激的對(duì)照組,通過(guò)Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FN,COL3,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 3,MMP3),α-SMA 和 survivin 表達(dá)水平的變化,同樣用Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子的改變。為進(jìn)一步探索溴芬酸鈉抑制TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成和肌成纖維細(xì)胞激活的具體機(jī)制,用PI3K抑制劑wortmannin,MEK抑制劑U0126以及GSK-3β抑制劑LiCl和SB216763分別作用于TGF-β1刺激的HPFs及HConFs細(xì)胞,以期研究AKT,ERK1/2和GSK-3β信號(hào)分子對(duì)HPFs及HConFs細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)生成和肌成纖維細(xì)胞激活的影響。用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞FN,COL3及α-SMA蛋白表達(dá)水平的變化,同樣用Western Blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子的改變。結(jié)果TGF-β1暴露48h可以誘導(dǎo)HPFs及HConFs細(xì)胞中FN,COL3及α-SMA蛋白表達(dá)升高,并促進(jìn)細(xì)胞遷移及增殖。同時(shí)加入溴芬酸鈉處理可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN,COL3及α-SMA蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞遷移及增殖。TGF-β1 通過(guò)快速磷酸化 AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK 等信號(hào)分子,從而促進(jìn)HPFs及HConFs細(xì)胞纖維化,其中TGF-β1誘導(dǎo)的p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平受到溴芬酸鈉的抑制。另外,單用溴芬酸鈉處理HPFs及HConFs細(xì)胞,不僅在蛋白水平和mRNA水平都抑制了 FN,COL3,α-SMA及survivin的表達(dá),也抑制了信號(hào)分子p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平。用抑制劑阻斷PI3K/AKT通路(wortmannin),MEK/ERK通路(U0126)或者GSK-3β通路(LiCl或者SB216763)均可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN,COL3及α-SMA的表達(dá)。使用LiCl失活GSK-3β能夠升高p-GSK-3β-S9的水平,但并不能逆轉(zhuǎn)溴芬酸鈉對(duì)FN,COL3及α-SMA蛋白表達(dá)的抑制,相反,用LiC1升高p-GSK-3β-S9的水平伴隨著FN,COL3及α-SMA蛋白表達(dá)水平的降低。結(jié)論溴芬酸鈉能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HPFs及HConFs細(xì)胞的胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞遷移及增殖。溴芬酸鈉通過(guò)影響AKT和ERK1/2通路,抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)生成和肌成纖維細(xì)胞激活。而用LiCl或者SB216763抑制GSK-3β的活性,能夠抑制TGF-βl誘導(dǎo)的HPFs及HConFs細(xì)胞的胞外基質(zhì)生成、肌成纖維細(xì)胞激活。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R777.33
【部分圖文】：

位論文邐正文第一部分第１節(jié)原代ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞的提�。螅龋茫铮睿疲�，邋ＨＣｏｎＥｓ，邋ＨＦＦｓ，邋Ｈｅｌａ邋五種細(xì)胞的形態(tài)鑒定逡逑微鏡下形態(tài)觀察顯示，ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞都呈典細(xì)胞形態(tài)，？而Ｈｅｌａ和ＨＣｏｎＥｓ細(xì)胞則呈典型的多邊形扁平

正文第…部分第１節(jié)原代ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定逡逑究枿機(jī)選取３個(gè)病人的ＨＰＦｓ和３個(gè)眼球捐贈(zèng)者的ＨＣｏｎＦｓ進(jìn)行ｗｅｓｔｅｒｎ實(shí)驗(yàn)鑒定逡逑（圖１．２），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞都明顯表達(dá)ＦＮ和ＣＯＬ３；逡逑而Ｈｅｌａ細(xì)胞的ＦＮ和ＣＯＬ３蛋白的表達(dá)為陰性。ＨＦＦｓ，ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞都高逡逑水平表達(dá)ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋（用２個(gè)不同貨號(hào)的產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證）；而Ｈｅｌａ細(xì)胞的ｖｉｍｅｎｔｉｎ表逡逑達(dá)水平較低。對(duì)于上皮細(xì)胞標(biāo)志ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ蛋白，Ｈｅｌａ細(xì)胞表達(dá)高水平ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ；逡逑而ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ細(xì)胞基本不表達(dá)ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ蛋白。逡逑－Ｖ５邋爺邋￣逡逑／邋／邋／邋／邋／邋／邋／邋／逡逑Ｃ0Ｌ３逡逑ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑（２２0３ｉ）丨r>＊逡逑ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑（１０３６６）丨U五義希穡幔睿耄澹潁幔簦椋鑠義希紓幔穡洌楨濉觶恚輳輳穡酰齲穡穡輳穡輳恚殄義賢跡保玻澹鰨澹螅簦澹潁釷笛榧觳猓齲疲疲�，邋｝x澹歟嵯赴約八婊∪〉模齲校疲蠛停齲茫錚睿疲笙赴繡義希疲危澹茫希蹋�，邋Ｓz椋恚澹睿簦椋鑠搴灣澹穡幔睿耄澹潁幔簦椋鑠宓鞍妝韽姿健ｅ義賢甲ⅲ荷戲較赴蟾嗪盼∪嘶蛘哐矍蚓柙叩男蠔�，左侧Ｓz椋恚澹睿簦椋詈蟾ㄥ義蝦拍詒嗪盼固寤鹺擰ｅ義希玻炊裕齲校疲螅澹齲茫錚睿疲�，邋｝x疲疲�，邋｝x澹歟崴鬧窒赴恚幔潁耄澹虻南赴庖哂餳ㄥ義希齲疲疲笞魑糶遠(yuǎn)哉眨ū曜枷宋赴

本文編號(hào)：2810804