【摘要】：目的:通過(guò)脂多糖預(yù)處理研究?jī)?nèi)毒素耐受對(duì)于大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎的作用,并觀察包括白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶M在內(nèi)的相關(guān)分子的表達(dá)改變方法:90只雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分配到三個(gè)實(shí)驗(yàn)組:正常對(duì)照組(NC)、內(nèi)毒素耐受組(ET)和內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組(EIU),每組30只。通過(guò)皮下注射脂多糖(200μg)誘導(dǎo)Wistar大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎(EIU、ET)。在誘導(dǎo)模型前連續(xù)五天,給予大鼠腹腔注射小劑量脂多糖(0.1 mg/kg)(ET)或其溶劑(EIU、NC)。內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎24小時(shí)后,使用裂隙燈檢查大鼠眼部炎癥后處死大鼠并取眼球。通過(guò)組織病理學(xué)檢查判斷大鼠眼內(nèi)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot研究NF-k B的激活情況以及IRAK-1、IRAK-4和IRAKM的表達(dá)。結(jié)果:脂多糖的重復(fù)預(yù)處理顯著抑制了眼內(nèi)炎癥(P0.001)及NF-κb p65在細(xì)胞核內(nèi)蛋白表達(dá)的表達(dá)(P0.01)。內(nèi)毒素耐受組中IRAK-1和IRAK-4的m RNA及蛋白表達(dá)較內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組(EIU)明顯受到抑制(P0.01),而IRAKM的m RNA及蛋白表達(dá)則有所上升(P0.01)。結(jié)論:內(nèi)毒素耐受對(duì)于內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎有保護(hù)作用,IRAK-M通過(guò)Toll樣受體信號(hào)通路的上調(diào)可能是內(nèi)毒素耐受發(fā)生的原因。目的:使用包含m RNA及長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA)的高通量基因芯片,研究紅芪多糖預(yù)處理內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎大鼠后的差異表達(dá)m RNA及長(zhǎng)鏈非編碼RNA。通過(guò)基因功能富集分析(Gene Ontology,GO),信號(hào)通路分析(Pathway analysis)和共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等篩選出具有研究?jī)r(jià)值的基因。方法:使用紅芪多糖(400mg/kg)或生理鹽水于脂多糖注射前24小時(shí)及1小時(shí)前腹腔注射各預(yù)處理5只Wistar大鼠后,使用脂多糖(200μg)誘導(dǎo)大鼠葡萄膜炎。觀察大鼠眼內(nèi)炎癥臨床表現(xiàn)后提取大鼠虹膜睫狀體組織RNA并使用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)的m RNA及l(fā)nc RNA基因。運(yùn)用基因功能富集分析(Gene Ontology,GO)、信號(hào)通路分析和共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)篩選出的差異基因之間的調(diào)控作用進(jìn)行深入分析并篩選出靶基因。結(jié)果:經(jīng)紅芪多糖預(yù)處理的大鼠在脂多糖刺激后眼部炎癥收到顯著抑制(P0.05)。以FC(abs)1.5和P值0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出254個(gè)差異表達(dá)的m RNA基因及68個(gè)lnc RNA基因。GO分析顯示差異基因顯著功能主要集中在脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來(lái)源分子反應(yīng)、趨化因子活動(dòng)、趨化因子受體結(jié)合、淋巴細(xì)胞遷徙、淋巴細(xì)胞遷徙正調(diào)控、細(xì)胞因子活動(dòng)、淋巴細(xì)胞趨藥性和白細(xì)胞遷徙等。而差異基因的顯著信號(hào)通路則包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路、炎癥調(diào)控趨化因子及細(xì)胞因子信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出表達(dá)于網(wǎng)絡(luò)核心位置的16個(gè)m RNA和7個(gè)lnc RNA基因。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖通過(guò)多條與炎癥及免疫相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎的抗炎作用。通過(guò)一系列篩選過(guò)程獲得了多個(gè)備選的抗炎靶基因,其中通過(guò)上調(diào)富亮氨酸重復(fù)蛋白-1和下調(diào)基因集落刺激因子1以及通過(guò)lnc RNA調(diào)控NF-κB發(fā)揮抗炎作用有較大的可能和研究?jī)r(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R773.9
【圖文】：

3.1. 脂多糖重復(fù)刺激對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎有預(yù)防作用脂多糖注射后24小時(shí)，內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎（EIU）組的大鼠眼部可見(jiàn)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，包括瞳孔閉鎖及纖維滲出膜（圖1a）。與內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組的大鼠相比，接受了小劑量脂多糖反復(fù)預(yù)刺激的內(nèi)毒素耐受（ET）組的大鼠眼部炎癥受到明顯抑制（圖1b）。內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組大鼠的臨床評(píng)分為5.8 ±0.523。內(nèi)毒素耐受組大鼠的臨床評(píng)分較內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組大鼠則有顯著降低，分?jǐn)?shù)為0.65 ± 0.671（P<0.01, 圖2）。圖1：(a) 內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎（EIU）組大鼠在LPS注射24小時(shí)后可觀察到瞳孔閉塞及纖維蛋白膜（箭頭所指）。(b) 內(nèi)毒素耐受（ET）組大鼠在LPS注射24小時(shí)后僅可見(jiàn)虹膜血管擴(kuò)張（箭頭所指）。(c) 正常對(duì)照組大鼠眼部未觀察到炎癥表現(xiàn)。

部炎癥受到明顯抑制（圖1b）。內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組大鼠的臨床評(píng)分為5.8 ±0.523。內(nèi)毒素耐受組大鼠的臨床評(píng)分較內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組大鼠則有顯著降低，分?jǐn)?shù)為0.65 ± 0.671（P<0.01, 圖2）。圖1：(a) 內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎（EIU）組大鼠在LPS注射24小時(shí)后可觀察到瞳孔閉塞及纖維蛋白膜（箭頭所指）。(b) 內(nèi)毒素耐受（ET）組大鼠在LPS注射24小時(shí)后僅可見(jiàn)虹膜血管擴(kuò)張（箭頭所指）。(c) 正常對(duì)照組大鼠眼部未觀察到炎癥表現(xiàn)。

***P < 0.001.LPS接種24小時(shí)后的組織病理學(xué)評(píng)估結(jié)果與臨床觀察到的炎癥程度一致，具體評(píng)分在圖3中顯示。內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎（EIU）組大鼠在顯微鏡下可見(jiàn)嚴(yán)重的葡萄膜炎表現(xiàn)，包括嚴(yán)重的纖維滲出以及大量的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)。同樣還可以看到充血、血管壁旁水腫、睫狀體擴(kuò)張和血管擴(kuò)張（圖4a）。內(nèi)毒素耐受組（ET）的葡萄膜炎炎癥表現(xiàn)較內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎組則顯著減輕，炎癥細(xì)胞也明顯減少（P<0.01，圖4b）。

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本文編號(hào)：2791272