發(fā)布時間：2020-08-08 18:01

【摘要】：研究目的:阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)和慢性阻塞性肺疾病(COPD)是最常見的兩種慢性呼吸系統(tǒng)性疾病,兩病共存稱為呼吸重疊綜合征(OS)。由于OSA和COPD兩種疾病均可引起體內(nèi)氧化及抗氧化失衡和白細胞的激活以及功能紊亂,所以容易誘發(fā)全身系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng),增高體內(nèi)炎癥因子水平,促進重疊綜合征病情進展和加重。從病理生理過程來看,OSA與COPD患者均會出現(xiàn)低氧血癥。OSA和COPD兩類患者的缺氧特征分別表現(xiàn)為夜間睡眠期間的間歇性缺氧與持續(xù)慢性缺氧。因缺氧導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng),致使與之有關(guān)的炎癥因子呈級聯(lián)放大瀑布式反應(yīng),從而引起相關(guān)并發(fā)癥,比如肺動脈高壓、動脈粥樣硬化、心血管疾病等。COPD和OSA都是心血管疾病的獨立危險因素,可見在OSA與COPD兩病共存的情況下,其有更高的心血管疾病合并癥風險,死亡率更高,預(yù)后更差。目前對重疊綜合征及其合并癥的研究主要集中于臨床和流行病學方面,其它方面的研究還很少,尤其在細胞學方面的研究。本課題探索性地提出從細胞水平研究重疊(間歇伴持續(xù))模式低氧暴露下血管內(nèi)皮細胞和中性粒細胞共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的損傷機制,血管內(nèi)皮細胞和中性粒細胞交互作用機制及抗氧化劑Tempol和炎癥通道的阻斷劑PTDC進行干預(yù)后對血管內(nèi)皮細胞的保護作用,以期為揭示重疊綜合征患者并發(fā)心血管疾病的可能發(fā)病機制與可行干預(yù)措施提供必要理論和實驗依據(jù)。研究內(nèi)容:1、從細胞水平研究間歇伴持續(xù)低氧暴露下中性粒細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)對血管內(nèi)皮細胞損傷機制及各機制間相關(guān)性分析。2、細胞交互作用在重疊(間歇伴持續(xù))低氧暴露所致血管內(nèi)皮細胞損傷中的重要性及細胞間黏附分子-1的作用研究。3、從細胞水平探究抗氧化劑Tempol和炎癥通道的阻斷劑PTDC對間歇伴持續(xù)低氧暴露所致血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。研究方法:第一部分:從健康志愿者抽取空腹外周靜脈血,應(yīng)用雙層密度梯度離心法分離中性粒細胞,然后將中性粒細胞與制備好的人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)4小時,后應(yīng)用呼吸仿真系統(tǒng)(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸與危重癥學科)進行不同低氧模式(N、IH、CH、OS)的分組暴露,時間分為2小時、5小時、8小時,各組分別留取中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)上清液、血管內(nèi)皮細胞。共進行10次試驗即n=10。通過ELISA法檢測上清液的炎癥因子IL-6,TNF-α及粘附分子ICAM-1。化學試劑法檢測CAT活性、MDA濃度。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測內(nèi)皮細胞促凋亡基因Bak和抗凋亡基因Bcl-xl mRNA表達水平。第二部分:將中性粒細胞與內(nèi)皮細胞直接共培養(yǎng)的OS組與單純內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的OS(H)組同時置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時,然后應(yīng)用天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科呼吸仿真系統(tǒng)進行間歇伴持續(xù)低氧暴露8小時,暴露后分別收集上清液和內(nèi)皮細胞。檢測指標(同第一部分)。第三部分:將提取的中性粒細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后,一組進行常氧暴露設(shè)為N組,其余三組均進行間歇伴持續(xù)低氧暴露,不加入任何試劑的設(shè)為OS組,加入Tempol的設(shè)為(OS+T)組,加入PTDC的設(shè)為(OS+P)組,每組分別進行2小時、5小時、8小時低氧暴露。暴露后分別收集上清液和內(nèi)皮細胞。檢測指標(同第一部分)。研究結(jié)果:第一部分:1、上清液炎癥因子、粘附分子、氧化應(yīng)激各指標比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同且具有時間依賴性:所檢測各指標各組與N組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05);TNF-a、IL-6、ICAM-1、MDA水平OS組高于IH組、CH組,CAT活力值OS組低于IH組、CH組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、內(nèi)皮細胞凋亡基因表達水平比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:各指標各組與N組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05);OS組Bcl-x1、Bcl-x1/BAK表達水平低于IH組、CH組,BAK表達水平高于IH組、CH組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);隨著低氧暴露時間的延長,促凋亡基因及抑凋亡基因表達水平均表現(xiàn)出增加趨勢,而Bcl-x1/BAK水平呈下降趨勢,提示促凋亡基因起主要作用。3、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標、凋亡基因的相關(guān)性分析:炎癥因子IL-6和TNF-α與抗氧化指標CAT呈較強負相關(guān),與氧化應(yīng)激指標MDA呈較強正相關(guān),P0.05;炎癥因子IL-6和TNF-α與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強負相關(guān),P0.05;抗氧化指標CAT與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強正相關(guān),氧化應(yīng)激指標MDA與凋亡基因Bcl-xl/BAK比值呈較強負相關(guān),P0.05。第二部分:1、OS(H)組與OS組各指標比較:OS(H)組IL-6、TNF-α、ICAM-1、MDA、BAKmRNA表達水平、Bcl-xl mRNA表達水平均低于OS組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),OS(H)組CAT的活力值、Bcl-xl/BAK比值均高于OS組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、ICAM-1與各變量相關(guān)性分析:ICAM-1與IL-6、TNF-α、MDA呈較強的正相關(guān);與CAT、Bcl-xl/BAK呈較強的負相關(guān),P0.05。第三部分:1、上清液炎癥因子、粘附分子及氧化應(yīng)激指標比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA水平OS組高于N組、OS+T組、OS+P組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);OS+T組及OS+P組高于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計學意義;且隨著暴露時間的逐漸延長,TNF-a、IL-6、ICAM-1及MDA濃度有升高趨勢。CAT活力值OS組低于N組、OS+T組、OS+P組,OS+T組及OS+P組低于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計學意義;但隨著低氧暴露時間的延長,CAT有下降趨勢。2、內(nèi)皮細胞凋亡基因表達水平比較:結(jié)果顯示2h、5h、8h低氧暴露各組趨勢相同:OS組抑凋亡基因Bcl-x1表達水平及Bcl-x1/BAK比值低于N組、OS+T組、OS+P組,促凋亡基因BAK表達水平高于N組、OS+T組、OS+P組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);OS+T組及OS+P組抑凋亡基因Bcl-x1表達水平及Bcl-x1/BAK比值低于N組,OS+T組及OS+P組促凋亡基因BAK表達水平高于N組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);OS+T組與OS+P組比較差異無統(tǒng)計學意義。隨著低氧暴露時間的延長,促凋亡基因及抑凋亡基因表達水平均表現(xiàn)出增加趨勢;而Bcl-x1/BAK水平呈下降趨勢。研究結(jié)論:根據(jù)本課題研究可以得出如下結(jié)論:1、中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后間歇伴持續(xù)低氧暴露模式與常氧模式、間歇低氧模式、持續(xù)低氧模式相比炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激更劇烈、內(nèi)皮細胞凋亡加速更明顯,內(nèi)皮損傷更嚴重。提示炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、及凋亡基因共同參與了重疊低氧暴露所致血管內(nèi)皮細胞受損。2、重疊低氧暴露模式所致血管內(nèi)皮細胞損傷具有時間依賴性,隨著作用持續(xù)時間的增加,所致血管內(nèi)皮細胞的損傷也在逐漸加重。3、氧化應(yīng)激、炎癥、及內(nèi)皮細胞凋亡基因均參與了重疊低氧模式所致血管內(nèi)皮細胞損傷,三者之間兩兩存在強相關(guān)性�；ハ啻龠M,循環(huán)往復(fù),使血管內(nèi)皮細胞損傷呈級聯(lián)放大瀑布式加重。4、重疊低氧狀態(tài)下中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞的交互作用使內(nèi)皮細胞損傷相關(guān)的炎癥、氧化應(yīng)激及內(nèi)皮細胞凋亡更加劇烈。即中性粒細胞與內(nèi)皮細胞間的交互作用促使重疊低氧模式暴露下所致血管內(nèi)皮細胞損傷更嚴重,5、黏附分子ICAM-1與炎癥因子、氧化/抗氧化指標及凋亡基因均存在強相關(guān)性,在內(nèi)皮細胞損傷機制中起了重要作用。6、重疊低氧暴露模式所致血管內(nèi)皮細胞炎癥因子及黏附分子增加,氧化應(yīng)激增強及內(nèi)皮細胞凋亡加速均可被抗炎及抗氧化劑部分抑制�？寡准翱寡趸深A(yù)可以起到保護血管內(nèi)皮細胞的作用。具有治療重疊綜合征并發(fā)心血管疾病的潛力。7、抗炎及抗氧化治療早期應(yīng)用即產(chǎn)生效果,提倡早干預(yù),早治療。可以避免產(chǎn)生不良后果,導(dǎo)致多臟器功能受損。8、抗炎及抗氧化干預(yù)僅可部分保護血管內(nèi)皮細胞,仍不能完全逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷,考慮與內(nèi)皮細胞損傷機制的多分子通道途徑有關(guān)。期待更進一步的研究能夠通過多靶點精準治療完全逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷。9、低氧導(dǎo)致炎癥與氧化應(yīng)激具有強的相關(guān)性,試劑Tempol及PDTC都具有清除氧自由基ROS的抗氧化作用及抑制炎癥通道NF-κB的抗炎作用,兩種試劑的抗炎及抗氧化作用無明顯差異。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R766;R563.9
【圖文】：

圖 1：COPD 和 OSA 在易患心血管疾病的炎癥機制中的相互作用。 除腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-8（IL-8）外，COPD 和 OSA 均與 C 反應(yīng)蛋白（CRP）和白細胞介素-6（IL-6）水平升高有關(guān)， 并且還與氧化應(yīng)激有關(guān)。 然而，吸煙和肥胖是這些關(guān)聯(lián)中的混淆變量。 缺氧是 OSA 中 TNF-α產(chǎn)生升高的關(guān)鍵因素，這與重疊綜合征特別相關(guān)。 每種炎癥途徑都與動脈粥樣硬化和隨后的心血管疾病有關(guān)。

課題總技術(shù)路線圖

圖 1.1 不同低氧暴露各組不同時段 TNF-a 濃度比較表 1.2 不同低氧暴露各組不同時段 IL-6 濃度比較（pg/ml n=10 x±S）組別 2h 5h 8hN 7.22±2.85c7.58±2.36c8.04±2.82dIH 34.70±8.83b46.59±19.32b107.30±28.79b*#CH 27.74±8.26b36.46±10.22b79.42±30.32c*#OS 53.09±20.05a67.46±13.17a*148.94±24.26a*#F 25.823 37.764 59.905P 0.000 0.000 0.000同列標注不同字母(a>b>c>d)P＜0.05，與 2h 比較，*P＜0.05；與 5h 比較，#P＜0.05。

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