【摘要】：目的:將慢病毒介導(dǎo)的CREG基因轉(zhuǎn)染至661W細(xì)胞,通過(guò)觀察過(guò)表達(dá)CREG基因修飾的661W細(xì)胞在光損傷條件下的抗凋亡能力,評(píng)價(jià)CREG基因?qū)飧惺芷骷?xì)胞光損傷時(shí)的保護(hù)作用,探討其作用機(jī)制。方法:1、培養(yǎng)細(xì)胞,對(duì)661W細(xì)胞株和293T細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)、凍存并計(jì)數(shù)。2、構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的CREG基因表達(dá)載體。3、轉(zhuǎn)染661W細(xì)胞,Western blot驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)的CREG基因轉(zhuǎn)染661W細(xì)胞的表達(dá);獲得慢病毒介導(dǎo)CREG基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的~(CREG)661W細(xì)胞和GFP空載體對(duì)照~(GFP)661W細(xì)胞。4、制備~(CREG)661W細(xì)胞和~(GFP)661W細(xì)胞光損傷模型并將正常的661W細(xì)胞(~(Normal)661W)設(shè)為正常空白組。5、Hoechst/PI染色法檢測(cè)各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變情況,觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的差異;BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度,蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中不同凋亡相關(guān)蛋白Caspase3/8/9、Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。6、應(yīng)用P38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125及ERK抑制劑PD98059預(yù)處理各組細(xì)胞,Western blot檢測(cè)光損傷后MAPK凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白P38、JNK、ERK及它們的磷酸化形式的表達(dá)量,對(duì)蛋白條帶灰度值統(tǒng)計(jì)和定量分析,從而對(duì)CREG基因修飾的661W細(xì)胞是否對(duì)光損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用及其作用機(jī)制進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果:1、pLvx-puro-CREG質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至293T病毒包裝細(xì)胞中且轉(zhuǎn)染效率大于70%。2、慢病毒成功感染至661W細(xì)胞中,嘌呤霉素重復(fù)篩選后建立穩(wěn)定的~(CREG)661W細(xì)胞系。3、CREG蛋白的Western印跡分析證實(shí)了慢病毒介導(dǎo)的E1A激活基因阻遏子(CREG)基因感染的成功。4、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)分析LD~(CREG)661W與其他組LD~(Normal)661W和LD~(GFP)661W相比較,細(xì)胞凋亡明顯減少(P0.05)。5、Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,光損傷實(shí)驗(yàn)組Caspase3/8/9及Bax的蛋白表達(dá)量均低于光損傷對(duì)照組(P0.01),而光損傷實(shí)驗(yàn)組Bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著高于光損傷對(duì)照組(P0.01)。6、Western blot檢測(cè)抑制劑預(yù)處理~(CREG)661W細(xì)胞顯示JNK、P38、ERK磷酸化與非磷酸化蛋白比值表達(dá)量較對(duì)照組有不同程度的降低,p-JNK/JNK及p-P38/P38相比差異較顯著,p-ERK/ERK相比次之(P0.05)。結(jié)論:1、通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的CREG基因轉(zhuǎn)染661W細(xì)胞可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的~(CREG)661W細(xì)胞系。2、攜帶CREG基因的視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞(~(CREG)661W細(xì)胞)抑制光損傷凋亡能力明顯增強(qiáng)。3、MAPK信號(hào)通路中的JNK及P38是抑制視網(wǎng)膜光損傷感光細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R774.1
【圖文】：

轉(zhuǎn)染pLvx-puro-CREG的293T細(xì)胞發(fā)出綠色熒光

感染CREG基因24h后的661W細(xì)胞發(fā)出綠色熒光

感染CREG基因重復(fù)篩選后的661W細(xì)胞發(fā)出綠色熒光

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2773287