【摘要】：背景:糖尿病視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)系由糖尿病引起的眼部視網膜微血管損傷的一種遠期并發(fā)癥,是全世界失明的最主要原因。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸的中間代謝產物,血Hcy高水平會誘發(fā)視網膜神經節(jié)細胞的凋亡。葉酸參與Hcy的代謝過程,葉酸的吸收、代謝障礙可影響同型半胱氨酸甲基化為甲硫氨酸,從而導致同型半胱氨酸累積,補充葉酸治療后可顯著降低循環(huán)中Hcy的水平。有研究表明Hcy和糖尿病視網膜病變之間存在關聯(lián),但結果是互相矛盾的。補充葉酸治療來降低或者延緩DR發(fā)生的機理尚不清楚。目的:(1)研究高同型半胱氨酸血癥與糖尿病視網膜病變之間的關系。(2)研究葉酸減輕糖尿病小鼠眼球局部的炎性反應、降低視網膜病變風險的保護性作用及機制。(3)探究葉酸聯(lián)合二甲雙胍在糖尿病小鼠中的應用,在降低血糖濃度的同時降低視網膜病變的風險。(4)探究口服葉酸在糖尿病患者視網膜病變的保護作用。方法:(1)同型半胱氨酸對糖尿病視網膜病變影響的系統(tǒng)評價和Meta分析:通過檢索中國知網、萬方數(shù)據(jù)、PubMed、Cochrane library和EMBASE數(shù)據(jù)庫,檢索時間均為自數(shù)據(jù)庫建立起至2017年11月為止。按預先制定的納入與排除標準,對于符合標準的文獻,由2位評價員嚴格按照納入標準獨立篩選、提取資料,并進行偏倚風險評估后,使用STATA軟件進行Meta分析,采用GRADE profiler3.6軟件評價證據(jù)質量,進行質量等級分級。用固定效應模型或隨機效應模型合并比值比(OR)值及95%可信區(qū)間(CI)分析同型半胱氨酸和糖尿病視網膜病變風險之間的關系并進行亞組分析,采用敏感性分析評估結果的穩(wěn)定性,用漏斗圖評估文獻的發(fā)表偏倚。(2)葉酸對小鼠視網膜病變的保護作用及其機制:(1)糖尿病小鼠的飼養(yǎng)、血糖和體重的測定:7周齡SPF級2型糖尿病模型小鼠(db/db小鼠)60只和同周齡的健康C57BL/KsJ(WT)小鼠15只。每周檢測一次空腹血糖,同時每日監(jiān)測小鼠的體重變化情況,直至實驗結束。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,并在SPSS軟件(20.0)中進行統(tǒng)計學分析,設P≤0.05具有統(tǒng)計學意義。(2)葉酸對2型糖尿病小鼠的視網膜病變的保護性作用:將60只db/db小鼠隨機分為四組:葉酸組15只、陰性對照組15只、二甲雙胍組15只、二甲雙胍聯(lián)合葉酸組15只。另外15只正常C57BL/Ks小鼠作為空白對照組。葉酸組小鼠每日以71μg/kg的葉酸溶液100μl灌胃,二甲雙胍組每日以120 mg/kg的二甲雙胍溶液100μl灌胃,二甲雙胍聯(lián)合葉酸組每日以71μg/kg的葉酸溶液100μl和120 mg/kg的二甲雙胍溶液100μl灌胃,陰性對照組和健康空白對照組以等體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥4周。每周檢測一次空腹血糖,每日監(jiān)控小鼠體重變化。4周給藥周期結束后,每只小鼠在處死前行光學相干斷層掃描(OCT)和眼底鏡檢查。處死小鼠,摘除眼球后取血,用ELISA檢測胰島素、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、白介素IL-1β(interleukin 1 beta,IL-1β)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。取視網膜組織,通過q-PCR檢測視網膜組織Il-1β基因和vegf基因的相對表達量;用WB檢測視網膜組織NOX4和VAV2的蛋白表達量。HE染色觀察黃斑視網膜厚度;通過免疫組化(immunohistochemistry,IHC)和免疫熒光技術(immunofluorescence,IF)檢測視網膜組織上CD31、VEGFR、3-NT、4-HNE、NLRP3等細胞因子的表達量。所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,并在SPSS軟件(20.0)中進行統(tǒng)計學分析,設P≤0.05具有統(tǒng)計學意義。(3)葉酸對非增殖性糖尿病患者視網膜病變保護作用的研究:選取2017年5月至2017年11月就診于蘭州大學第一醫(yī)院眼科的30名2型糖尿病非增殖性視網膜病變患者作為研究對象,采用前瞻性臨床隨機對照實驗的研究方法。15名患者納入對照組,每日接受1.0g二甲雙胍降糖治療;另外15名患者納入聯(lián)合治療組,在服用二甲雙胍基礎上每日加服5mg葉酸。經過半年治療后,觀察兩組患者血葉酸濃度、血同型半胱氨酸、空腹血糖、空腹胰島素、糖化血紅蛋白、視網膜出血點數(shù)量、黃斑視網膜厚度(μm)等指標的變化。定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,并在SPSS軟件(20.0)中進行統(tǒng)計學分析,設P≤0.05具有統(tǒng)計學意義。結果:(1)共納入11篇研究,總計2184例糖尿病患者。Meta分析結果顯示:糖尿病患者同型半胱氨酸水平升高與糖尿病視網膜病變風險增高有關(OR:1.62;95%CI:1.29-2.03;P0.001)。盡管在所納入的研究中發(fā)現(xiàn)了顯著的異質性,但敏感性分析的結果仍然具有統(tǒng)計學意義。亞組分析發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸和糖尿病視網膜病變在大多數(shù)亞群之間有顯著的關聯(lián),但如果樣本量100,參與者有1型糖尿病或研究質量較低,則兩者沒有顯著關聯(lián)。(2)db/db小鼠的平均體重為42.6±3.41g,同周齡的健康小鼠平均體重為16.1±0.63g。糖尿病小鼠的平均空腹血糖濃度為21.0±1.3mmol/L,而健康小鼠的平均空腹血糖濃度為6.5±0.6mmol/L。(3)研究期間,葉酸組和陰性對照組小鼠的FBG(Fasting blood-glucose)和HbA1c(Haemoglobin A1c)濃度增加。在研究結束前,葉酸組的FBG和HbA1c分別達到28.2±1.4mmol/L和192.64±33.29ng/mL;陰性對照組的FBG和HbA1c分別為26.6±1.7mmol/L和226.44±32.13 ng/mL;而二甲雙胍組和聯(lián)合治療組的FBG和HbA1c濃度均下降且顯著低于葉酸組和陰性對照組(P0.05),二甲雙胍組FBG和HbA1c分別為18.7±1.5 mmol/L和171.05±22.81 ng/mL,聯(lián)合治療組FBG和HbA1c分別為19.8±1.4 mmol/L和151.42±22.91 ng/mL。二甲雙胍組和聯(lián)合治療組的小鼠空腹胰島素濃度也低于葉酸組和陰性對照組(P0.05)�？瞻讓φ战M為健康小鼠,FBG、HbA1c和空腹胰島素濃度均低于其他四組。(4)葉酸組小鼠血漿Hcy為7.35±1.18μmol/L,明顯低于對照組(陰性對照組為10.39±0.90μmol/L,聯(lián)合治療組為7.88±0.93μmol/L,二甲雙胍組為11.02±1.13μmol/L(P0.05)),但高于空白對照組(6.75±0.98μmol/L)。此外,ELISA、q-PCR、WB、IHC和IF等檢測結果表明4組db/db小鼠的IL-1β、VEGF、Il-1β基因、vegf基因、NOX4、VAV2、CD31、VEGFR、3-NT、4-HNE、NLRP3和其他細胞因子的表達水平高于空白對照組小鼠。這些細胞因子在陰性對照組視網膜組織中的表達顯著高于葉酸和空白組(P0.05);二甲雙胍組的各種炎癥因子的表達量顯著高于聯(lián)合治療組(P0.05)。治療結束后,OCT結果和視網膜組織病理學分析顯示空白組平均視網膜厚度最高(145.01±15.54μm),其次是聯(lián)合治療組(119.39±1.34μm),陰性對照組(104.59±2.09μm)和二甲雙胍組(91.77±7.52μm)。但是,眼底鏡檢查發(fā)現(xiàn)每組的眼底結構沒有顯著改變。(5)臨床研究中,二甲雙胍組(8.42±4.08 ng/mL)和聯(lián)合治療組(8.22±4.23 ng/mL)血清葉酸濃度基線值無顯著性差異。研究結束時,聯(lián)合治療組血清葉酸濃度(12.15±5.46 ng/mL)顯著高于二甲雙胍組(7.42±2.88 ng/mL)(P0.05)。聯(lián)合治療組的同型半胱氨酸濃度(8.15±2.21μmol/L)低于二甲雙胍組(12.16±2.34μmol/L)(P0.05)。聯(lián)合治療組空腹胰島素水平顯著升高(P0.05),從11.21±3.02mU/L升高至13.76±3.68mU/L,而HbA1c顯著降低,從6.01±1.36%降至4.61±1.25%(P0.05)。而二甲雙胍組空腹胰島素和HbA1c水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),分別由12.07±5.64mU/L變?yōu)?1.67±3.76mU/L,5.85±1.26%變?yōu)?.79±1.50%。治療結束時聯(lián)合治療組和二甲雙胍組之間空腹胰島素濃度和HbA1c無差異。OCT檢查顯示兩組黃斑視網膜厚度基線無顯著差異。在研究結束時,聯(lián)合治療組黃斑視網膜厚度為174.13±13.66μm,薄于二甲雙胍組(189.73±22.54μm)。雖然在研究之前或研究結束時兩組之間視網膜出血點的數(shù)量沒有顯著差異。結論:(1)本研究的結果表明,同型半胱氨酸水平升高與糖尿病視網膜病變的風險增加有關,特別是在2型糖尿病患者中。這一發(fā)現(xiàn)可能有助于糖尿病患者制定有效的管理策略,以預防糖尿病視網膜病變的進展。(2)糖尿病模型小鼠的成功飼養(yǎng)為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。(3)葉酸可降低血液中同型半胱氨酸的濃度,從而降低視網膜組織中NOX4,VAV2,CD31,VEGFR,3-NT,4-HNE等炎癥因子的水平。這些也導致炎癥反應、氧化應激和視網膜血管生成的減少,實現(xiàn)了對糖尿病視網膜病變的保護作用,而且這種保護作用也不依賴于降糖治療。(4)葉酸可能促進2型糖尿病患者的胰島素分泌,并具有與二甲雙胍協(xié)同降低血糖的作用。葉酸還可以降低2型糖尿病患者的同型半胱氨酸濃度,減少視網膜炎癥反應和視網膜水腫。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R774.1
【圖文】：

5圖 1-1 “葉酸在糖尿病視網膜病變中的保護作用及機制研究”基礎路線圖Fig.1-1 The process of protective effect and mechanism of folate in diabetic retinopathy

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本文編號：2769846