發(fā)布時間：2017-03-29 05:14

  本文關鍵詞：微生態(tài)環(huán)境對變應性鼻炎發(fā)病及機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：變應性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)又稱為過敏性鼻炎,是指具有特異性體質(zhì)的人接觸特定的變應原以后發(fā)生的鼻粘膜炎癥性疾病,這一病理過程主要是由IgE介導,涉及多種炎癥細胞和炎癥介質(zhì)、以及其他多種細胞因子的參與和釋放[1]。主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、清水樣涕及眼癢等癥狀[2]。隨著人們生活水平的提高,AR的發(fā)病率逐年增加,巨額的治療費用給家庭和社會都帶來了沉重的負擔[3]。目前對于AR的治療以脫敏療法和對癥治療為主[4],但患者依從性差、癥狀控制易反復,�？刹l(fā)哮喘,嚴重影響著患者的生活質(zhì)量[2]。因此,有效防治AR意義重大。近期研究發(fā)現(xiàn),變應性疾病在歐美等發(fā)達國家的發(fā)病率明顯高于其他欠發(fā)達國家[5],出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因無法單獨用種族差異或基因遺傳等因素解釋[6]。有學者認為,生活環(huán)境中微生物多樣性的減少可能與某些免疫性疾病和慢性炎癥疾病的發(fā)病率升高有關[5],如特應性皮炎和克羅恩病[7]。Strachan提出的“衛(wèi)生學說”認為,由于人類生活環(huán)境的逐漸改善和對于自身周圍衛(wèi)生條件越來越重視,導致了人體尤其是兒童時期接觸病原微生物的機會大大減少,使得兒童的免疫系統(tǒng)缺乏有效的刺激和調(diào)動,由此引發(fā)免疫系統(tǒng)對于某些本應屬于人體內(nèi)環(huán)境的正常菌群產(chǎn)生過度反應,最終導致變應性疾病發(fā)病率的升高[8]。那么AR的發(fā)生是否與鼻腔的微生態(tài)環(huán)境的改變有一定的關聯(lián)?AR患者鼻腔的微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了怎樣的改變?鼻腔微生態(tài)環(huán)境的改變?nèi)绾我餉R的發(fā)病?其機制是什么?為解答以上的問題,我們通過實驗研究了微生態(tài)環(huán)境改變對小鼠AR發(fā)病率的影響;應用16S rDNA高通量測序技術對AR患者和正常人鼻腔內(nèi)的菌群分布進行分析;選擇篩選出的差異菌與誘導的人外周血未成熟的樹突狀細胞共培養(yǎng)探索差異菌對ar的作用及機制。本研究揭示了鼻腔微生態(tài)環(huán)境與ar之間的關系,對進一步研究ar的防治具有重要意義。本研究分三部分:第一部分探討微生態(tài)環(huán)境的改變對小鼠變應性鼻炎(ar)發(fā)病率的影響方法:將60只新生的balb/c小鼠隨機分為2組,每組30只。一組置于超凈無菌環(huán)境(germ-free,gf,gf環(huán)境組),另一組置于無特定病原體環(huán)境(specificpathogen-free,spf,spf環(huán)境組)中飼養(yǎng)。2種環(huán)境中的小鼠再各分為模型組(20只)和對照組(10只)。2個模型組在6周齡時用卵清蛋白(ova)致敏并激發(fā),觀察其癥狀和體征并評分;于第9周末再次激發(fā)后取材,用蘇木精-伊紅染色法行鼻腔組織切片染色;應用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa法)檢測外周血血清中ige、ifn-γ和il-4濃度。結果:各組小鼠癥狀體征評分顯示,gf模型組中ar反應陽性體征的小鼠數(shù)量顯著高于spf模型組;蘇木精-伊紅染色顯示ar反應陽性小鼠鼻黏膜高度充血水腫,有大量炎性細胞浸潤,各模型組中ar反應陰性的小鼠和對照組的小鼠鼻黏膜無異常形態(tài);嗜酸性粒細胞(eos)計數(shù)顯示ar反應陽性小鼠鼻黏膜內(nèi)eos明顯增多;elisa結果顯示ar反應陽性小鼠血清中ige、il-4濃度顯著升高(p0.05),ifn-γ濃度顯著降低(p0.05)。結論:gf環(huán)境中小鼠ar的發(fā)病率高于spf環(huán)境。第二部分應用16srdna高通量測序技術探索ar患者與正常人群鼻腔微生態(tài)菌群的差異方法:在鼻內(nèi)鏡下用無菌咽拭子取8例ar患者及7例正常人鼻腔中鼻道分泌物,提取總的細菌全組dna,行16srdnav6區(qū)檢測。結果:測序后總共生成1,900.09mb的數(shù)據(jù),總共檢測的細菌范圍覆蓋35門、39綱、77目、179科、338屬和38種;通過分析對比發(fā)現(xiàn)ar患者鼻腔內(nèi)菌群otu數(shù)量(3176±623.6)大于正常人群(1771±397.2);主成分分析顯示放線菌目、乳桿菌目和假單胞菌目在ar患者和正常人群鼻腔中的差異性最大;otu分析顯示解沒食子鏈球菌、奈瑟菌和噬鹽單胞菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著高于正常人群,且均有統(tǒng)計學意義(p0.001);棒狀桿菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著低于正常人群,且具有統(tǒng)計學意義(p0.001);兩組樣本組內(nèi)比較顯示各組內(nèi)的細菌種類及數(shù)量無統(tǒng)計學差異(p0.05)。結論:ar患者與正常人群鼻腔微生態(tài)菌群存在顯著差異,解沒食子鏈球菌、奈瑟菌和噬鹽單胞菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著高于正常人群,假白喉棒狀桿菌在ar患者鼻腔內(nèi)的數(shù)量顯著低于正常人群,鼻腔菌群失調(diào)可能與ar的發(fā)生有關。第三部分差異菌與未成熟的樹突狀細胞共培養(yǎng)探索差異菌對樹突狀細胞功能的影響本實驗通過將第二部分實驗中篩選出的ar患者與正常人群鼻腔中存在顯著性差異的菌種,即c(corynebacteriumpseudodipheriticum)和s(streptococcusgallolyticus),分別與誘導的人外周血來源的未成熟的樹突狀細胞共培養(yǎng)后,觀察c、s對未成熟的樹突狀細胞的分化程度的影響。通過對th1/th2平衡因子的研究,探索c和s在ar發(fā)病中的分子學機制。方法:本研究分為idcs、c、cs、s和mdcs五組。應用humancd14microbeads分選人外周血pbmc中的cd14+細胞,用未成熟的樹突狀細胞誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)6d,誘導生成未成熟的樹突狀細胞。idcs組應用完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h;c、cs和s組分別將滅活的c、cs和s與人外周血誘導的未成熟的樹突狀細胞共培養(yǎng)48h;mdcs組應用tnf-α培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,刺激未成熟的樹突狀細胞向成熟的樹突狀細胞轉(zhuǎn)化。應用流式細胞術分別檢測五個組中樹突狀細胞表面共刺激分子cd80和cd86的變化;應用elisa技術檢測培養(yǎng)液中il-12的分泌水平;應用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察培養(yǎng)后各組的樹突狀細胞形態(tài)。最后,將以上五組培養(yǎng)后的細胞與cd4+t淋巴細胞以1:20、1:10和1:5的比例共培養(yǎng)48h,應用elisa法檢測培養(yǎng)液中ifn-γ和il-4的表達水平;應用mtt法檢測cd4+t細胞的增殖情況。結果:流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)s組中表達cd80和cd86的樹突狀細胞數(shù)量較idcs、c和cs組均顯著增高,且有統(tǒng)計學意義(p0.05);但與mdcs組無統(tǒng)計學差異;elisa檢測的結果顯示,s組培養(yǎng)液中il-12的分泌水平較idcs、c和cs組均降低,且有統(tǒng)計學意義(p0.05);但與mdcs組無統(tǒng)計學差異。場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)S組的細胞表面與mDCs組均有大量不規(guī)則樹突樣凸起,即典型的成熟狀態(tài)的樹突狀細胞。ELISA檢測各組細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng)后的IFN-γ水平檢測,iDCs組C組CS組S組mDCs組,且C組和S組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),各組組內(nèi)比較無統(tǒng)計學差異;IL-4水平檢測iDCs組C組CS組S組mDCs組,且C組和S組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),各組組內(nèi)比較無統(tǒng)計學差異。MTT結果顯示S組較iDCs、C和CS組CD4+T淋巴細胞增殖顯著增加,且具有數(shù)量依賴關系,當培養(yǎng)后的細胞與CD4+T淋巴細胞以1:5的比例時,CD4+T淋巴細胞的增殖能力最高。結論:Streptococcus gallolyticus可促進未成熟的樹突狀細胞向成熟的樹突狀細胞轉(zhuǎn)化,具有刺激CD4+T淋巴細胞增殖的能力;抑制CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ的表達量,促進CD4+T淋巴細胞分泌IL-4的表達量。Corynebacterium pseudodipheriticum可顯著抑制Streptococcus gallolyticus誘導的未成熟的樹突狀細胞向成熟的樹突狀細胞轉(zhuǎn)化。
【關鍵詞】：變應性鼻炎 微生態(tài)環(huán)境 16S rDNA 樹突狀細胞 Streptococcus gallolyticus Corynebacterium pseudodipheriticum CD4+T淋巴細胞
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R765.21
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-25
• 第一部分 微生態(tài)環(huán)境對小鼠變應性鼻炎發(fā)病率的影響25-34
• 1 材料25-26
• 2 方法26-28
• 3 結果28-31
• 4 討論31-34
• 第二部分 變應性鼻炎患者鼻腔微生態(tài)菌群的研究34-46
• 1 材料34-35
• 2 方法35-38
• 3 結果38-44
• 4 討論44-46
• 第三部分 差異菌對樹突狀細胞功能的影響46-67
• 1 材料46-48
• 2 方法48-54
• 3 結果54-64
• 4 討論64-67
• 小結67-68
• 參考文獻68-73
• 個人簡歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

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1 孔令平,劉妍,黃志勤;樹突狀細胞的特性與分化發(fā)育[J];贛南醫(yī)學院學報;2003年02期

2 趙謹 ,王心;樹突狀細胞(dendritic cells)[J];日本醫(yī)學介紹;2005年06期

3 張臨友,郭松,楊寶峰;激素與樹突狀細胞[J];國外醫(yī)學(移植與血液凈化分冊);2005年05期

4 吳萍萍;杜曉英;劉書遜;陳榮軍;壽張飛;陳江華;;不同來源人樹突狀細胞的培養(yǎng)誘導及鑒定[J];浙江醫(yī)學;2007年09期

5 ;封面圖片——樹突狀細胞[J];中國廠礦醫(yī)學;2009年04期

6 張錦X,陳海濱,謝慶東,王駿;人血樹突狀細胞形成細胞簇功能的體外觀察[J];解剖學雜志;1997年02期

7 曹華,張銳,裴雪濤;樹突狀細胞的生物學特性及臨床應用[J];基礎醫(yī)學與臨床;2000年06期

8 王黎明,劉艷榮,李金蘭,常艷,付家瑜,高暉,陳珊珊;人慢性粒細胞白血病樹突狀細胞的培養(yǎng)和鑒定[J];中華醫(yī)學雜志;2000年05期

9 夏青,張學軍;真皮樹突狀細胞與皮膚病[J];國外醫(yī)學.皮膚性病學分冊;2000年02期

10 劉青,金巖,吳織芬;樹突狀細胞與口腔疾病[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2000年06期

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1 蔣應明;萬濤;陳國友;夏大靜;周向陽;修方明;張意;曹雪濤;;樹突狀細胞來源的鈣粘著相關蛋白新基因的克隆、表達及功能研究[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

2 王勝軍;王麗莉;李堅;許化溪;;肺癌患者胸水中樹突狀細胞的誘導和初步鑒定[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

3 徐克成;牛立志;郭子倩;張德春;左建生;;樹突狀細胞及其在癌腫治療中應用[A];中國中西醫(yī)結合學會第十五次全國消化系統(tǒng)疾病學術研討會論文匯編[C];2003年

4 何廣勝;邵宗鴻;和虹;劉鴻;施白;潔均;曹燕然;Q

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