【摘要】：目的:喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,其中96-98%以上是喉鱗狀細(xì)胞癌。喉癌具有較強(qiáng)的侵襲與轉(zhuǎn)移性,盡管目前針對(duì)喉癌的手術(shù)、放化療以及靶向治療技術(shù)明顯進(jìn)步,但其五年生存率仍約為60.9%,較過去無明顯提高。為了提高喉癌患者的生存率,目前尋找治療喉癌新的治療靶點(diǎn)和治療手段有重要意義。染料木黃酮屬于大豆異黃酮復(fù)合物,它可以通過多種分子生物學(xué)機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用,包括絲裂原活化蛋白激酶MAPK,Akt以及JAK/STAT等。之前的研究顯示,染料木黃酮可以抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖,然而其抑制喉癌細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制仍未見研究報(bào)道。MicroRNAs是內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,它通過序列特異性來調(diào)控基因的表達(dá)。這種調(diào)控主要是通過與靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)域結(jié)合從而降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯。研究顯示,染料木黃酮可以調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá),但是在喉癌細(xì)胞中,染料木黃酮對(duì)miRNA表達(dá)的影響尚未見研究報(bào)道。P53基因人類發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因之一,它可以通過細(xì)胞周期阻滯、衰老和促凋亡來抑制腫瘤的發(fā)生。研究顯示染料木黃酮可以通過抑制P53蛋白的泛素化,上調(diào)其在乳腺癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。而另一方面,研究顯示P53蛋白則可以在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后加工水平調(diào)控部分miRNA的表達(dá),然而染料木黃酮調(diào)控miRNA的表達(dá)是否與P53蛋白的作用有關(guān)目前未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分,第一部分為檢測喉癌細(xì)胞中表達(dá)水平受染料木黃酮影響的miRNAs,第二部分研究染料木黃酮調(diào)控目標(biāo)miRNA表達(dá)發(fā)揮促喉癌細(xì)胞凋亡作用的下游靶基因,第三部分研究染料木黃酮上調(diào)miRNA表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槊鞔_染料木黃酮調(diào)控喉癌細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)的機(jī)制,從而闡明染料木黃酮調(diào)控miRNA發(fā)揮促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡作用的分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床應(yīng)用染料木黃酮作為抗喉癌治療藥物提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:采用基因芯片分析,檢測經(jīng)染料木黃酮處理后的喉癌細(xì)胞中miRNAs表達(dá)情況,篩選出表達(dá)明顯受染料木黃酮影響的miRNA,并檢測其對(duì)染料木黃酮促凋亡作用的影響。通過基因預(yù)測軟件TargetScan預(yù)測miR-1469的靶基因,并通過westernblot、雙熒光素酶基因報(bào)告、靶蛋白挽救實(shí)驗(yàn)明確其靶向調(diào)控關(guān)系,最后研究染料木黃酮上調(diào)miR-1469表達(dá)是否與P53蛋白的作用有關(guān)。第一部分:1.通過流式細(xì)胞儀檢測染料木黃酮對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡的影響。2.將TU212細(xì)胞用染料木黃酮處理48h后行芯片分析顯示,篩選表達(dá)水平明顯受染影響的miRNA。3.Real-timePCR證實(shí)芯片分析結(jié)果。4.建立miR-1469低表達(dá)喉癌細(xì)胞系,westernblot及流式細(xì)胞儀檢測染料木黃酮對(duì)其凋亡的影響。第二部分:1.通過miRNA靶基因預(yù)測軟件對(duì)miR-1469的靶基因進(jìn)行預(yù)測。2.建立miRNA-1469低表達(dá)喉癌細(xì)胞系,Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)其Mcl1和Bcl2表達(dá)的影響。3.建立miRNA-1469過表達(dá)喉癌細(xì)胞系,Westernblot檢測其Mcl1和Bcl2的表達(dá)水平。4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)明確miR-1469與靶基因的調(diào)控關(guān)系。5.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)Mcl1過表達(dá)喉癌細(xì)胞凋亡的影響。6.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)miRNA-1469和Mcl1雙低表達(dá)喉癌細(xì)胞凋亡的影響。第三部分:1.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)喉癌細(xì)胞內(nèi)P53蛋白表達(dá)的影響。2.Real-timePCR法檢測染料木黃酮對(duì)P53低表達(dá)喉癌細(xì)胞中miR-1469的影響。3.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)P53低表達(dá)喉癌細(xì)胞凋亡的影響。4.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)P53過表達(dá)喉癌細(xì)胞凋亡的影響。5.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)P53低表達(dá)、miRNA-1469過表達(dá)的喉癌細(xì)胞的凋亡的影響。6.Westernblot檢測染料木黃酮對(duì)P53和Mcl1雙低表達(dá)的喉癌細(xì)胞的凋亡的影響。結(jié)果:第一部分1.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示隨著genistein作用時(shí)間的延長,Hep-2與TU212細(xì)胞的凋亡率逐漸增加(P0.05)。2.基因芯片分析顯示經(jīng)染料木黃酮處理后TU212細(xì)胞中miRNA-1469表達(dá)水平明顯上調(diào)。3.Real-timePCR檢測結(jié)果顯示,結(jié)果顯示隨著genistein作用時(shí)間的延長,Hep-2與TU212細(xì)胞中miR-1469的表達(dá)水平逐步增加(P0.05)。4.Westernblot檢測顯示,與對(duì)照組相比,miR-1469低表達(dá)的Hep-2及TU212細(xì)胞經(jīng)染料木黃酮處理后,喉癌細(xì)胞凋亡水平明顯下降。5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示,與對(duì)照組相比,miR-1469低表達(dá)的TU212細(xì)胞經(jīng)染料木黃酮處理后,細(xì)胞凋亡率顯著下降(P0.05)。第二部分1.通過miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan,我們預(yù)測到miR-1469與凋亡抑制基因Bcl2和Mcl1的3'-UTR可能存在結(jié)合位點(diǎn)。2.Westernblot檢測顯示,染料木黃酮可以下調(diào)喉癌細(xì)胞中Mcl1和Bcl2蛋白的表達(dá),而下調(diào)細(xì)胞中miR-1469的表達(dá)后,Mcl1表達(dá)升高,而Bcl2表達(dá)仍降低。3.Westernblot檢測顯示,miR-1469過表達(dá)后,與對(duì)照組相比,Mcl1蛋白表達(dá)降低,而Bcl2蛋白表達(dá)無明顯改變。4.雙熒光素酶報(bào)告顯示,miR-1469可以與Mcl1的3'-UTR結(jié)合。5.Westernblot檢測顯示,經(jīng)染料木黃酮處理后,轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的Hep2細(xì)胞與TU212細(xì)胞的凋亡水平升高,而轉(zhuǎn)染Mcl1過表達(dá)質(zhì)粒的Hep2細(xì)胞與TU212細(xì)胞的凋亡水平降低。6.Westernblot檢測顯示,經(jīng)染料木黃酮處理后,與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比,單轉(zhuǎn)miR-1469inhibitor組PARP剪切蛋白表達(dá)降低,說明其凋亡被抑制,而雙轉(zhuǎn)miR-1469inhibitor+Mcl1shRNA組喉癌細(xì)胞凋亡水平再次升高。第三部分1.Westernblot檢測顯示隨著染料木黃酮作用時(shí)間的延長,喉癌細(xì)胞系中P53表達(dá)增加。2.Real-timePCR檢測顯示,與對(duì)照組相比,P53低表達(dá)TU212和Hep2細(xì)胞經(jīng)染料木黃酮處理后,miR-1469表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。3.Westernblot檢測顯示,與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比,P53低表達(dá)的TU212細(xì)胞和Hep2細(xì)胞經(jīng)染料木黃酮處理后,喉癌細(xì)胞凋亡水平明顯降低。4.Westernblot檢測顯示,經(jīng)染料木黃酮處理后,與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染P53過表達(dá)質(zhì)粒的TU212細(xì)胞和Hep2細(xì)胞中喉癌細(xì)胞凋亡水平升高。5.Westernblot檢測顯示,經(jīng)染料木黃酮處理后,與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比,單轉(zhuǎn)P53shRNA組喉癌細(xì)胞凋亡水平降低,而雙轉(zhuǎn)miR-1469mimic+P53shRNA組細(xì)胞凋亡水平再次升高。6.Westernblot檢測顯示,經(jīng)染料木黃酮處理后,與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比,單轉(zhuǎn)P53shRNA組的細(xì)胞凋亡水平降低,而雙轉(zhuǎn)Mcl1shRNA+P53shRNA組的凋亡水平再次升高。結(jié)論:1.染料木黃酮可以上調(diào)喉癌細(xì)胞中miR-1469的表達(dá)。2.miR-1469對(duì)喉癌細(xì)胞具有促凋亡作用,染料木黃酮通過上調(diào)miR-1469表達(dá)促進(jìn)喉癌細(xì)胞的凋亡。3.Mcl1是miR-1469的下游靶基因。4.染料木黃酮通過上調(diào)miR-1469表達(dá),進(jìn)而下調(diào)Mcl1表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡作用。5.染料木黃酮可以通過上調(diào)P53表達(dá)進(jìn)而上調(diào)miR-1469表達(dá)。6.染料木黃酮通過上調(diào)P53表達(dá)進(jìn)而上調(diào)miR-1469的表達(dá),miR-1469通過抑制其下游靶基因Mcl1的表達(dá),從而發(fā)揮促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡的作用。
【圖文】：

10圖 1.1 流式細(xì)胞儀檢測染料木黃酮對(duì) hep-2 和 TU212 細(xì)胞凋亡的影響圖中所示，流式細(xì)胞儀檢測凋亡顯示隨著染料木黃酮作用時(shí)間的延長，Hep-2 細(xì)胞（圖 B）與 TU212 細(xì)胞（圖 C）的凋亡率逐漸增加（P<0.05）。3.2 基因芯片分析顯示，，經(jīng)染料木黃酮處理后，TU212 細(xì)胞中 miRNA--1469 表達(dá)水平上調(diào)最為明顯我們將 TU212 細(xì)胞用染料木黃酮處理 48h 后行芯片分析顯示，與對(duì)照組相比miRNA-1469 表達(dá)上調(diào)最為明顯（圖 1.2 圖 1.3）。

基因芯片分析顯示，TU212經(jīng)染料木黃酮處理后，miRNA-1469表達(dá)上調(diào)最為明顯
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Apoptosis of human primary gastric carcinoma cells induced by genistein[J];World Journal of Gastroenterology;2004年12期

本文編號(hào)：2673450