發(fā)布時(shí)間：2020-05-13 11:09

【摘要】：研究背景和目的:糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,也是主要的不可逆致盲眼病之一,近年來(lái)發(fā)病率不斷上升。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚未完全闡明。既往研究證明,高血糖狀態(tài)增加了視網(wǎng)膜組織和毛細(xì)血管的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增加,同時(shí)糖尿病患者的抗氧化防御系統(tǒng)也受到損害;除此,過(guò)量的ROS也可以增加促炎因子的表達(dá),激活炎癥反應(yīng),炎癥反過(guò)來(lái)進(jìn)一步加劇了氧化應(yīng)激反應(yīng),從而形成一個(gè)氧化應(yīng)激和炎癥的惡性循環(huán)。萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是一種異硫氰酸鹽,富含于十字花科蔬菜,如卷心菜、西蘭花、蘿卜等,具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。已有研究證實(shí)SFN對(duì)于糖尿病腎病和心肌病具有保護(hù)作用,但是它對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變是否同樣存在保護(hù)意義尚不清楚。Nrf2/ARE信號(hào)通路可介導(dǎo)多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄,是抗氧化機(jī)制中的關(guān)鍵通路。SFN是否會(huì)影響視網(wǎng)膜細(xì)胞中Nrf2/ARE信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究。此外,據(jù)報(bào)道核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體可被氧化應(yīng)激反應(yīng)激活參與DR的病理過(guò)程。而Nrf2可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活性,因此,有必要探討Nrf2/ARE信號(hào)通路和NLRP3炎癥小體是否共同參與了DR的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步闡明SFN是否能夠通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路并抑制NLRP3炎癥小體來(lái)阻止DR的發(fā)展,有助于探索新的藥物靶點(diǎn),為糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)O(shè)計(jì)更為合理的治療方案提供依據(jù)。研究方法:雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley,SD)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)65 mg/kg,確診為糖尿病的大鼠進(jìn)行分組后,分別連續(xù)12周注射不同劑量的SFN(0.5 mg/kg/d或1 mg/kg/d)。大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞暴露于25 mmol/L葡萄糖與2.5μmol/L SFN中進(jìn)行體外培養(yǎng)。提取大鼠視網(wǎng)膜組織后,采用HE染色的方法進(jìn)行組織學(xué)分析;其次采用ELISA法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織和Müller細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β三種炎癥因子指標(biāo)的變化;試劑盒法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織和Müller細(xì)胞中抗氧化物GSH、SOD和CAT的表達(dá)水平;Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織和Müller細(xì)胞中血紅素氧合酶-1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化還原酶-1(NQO-1)的mRNA表達(dá)水平;EMSA法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Nrf2/ARE在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合量的變化情況。然后采用Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織和Müller細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)情況,其下游靶蛋白HO-1和NQO-1的表達(dá)水平以及NLRP3炎癥小體的組成成分NLRP3,cleaved caspase-1 p20,ASC的變化情況。最后,通過(guò)沉默Müller細(xì)胞中Nrf2基因,進(jìn)一步驗(yàn)證SFN通過(guò)Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的功能。結(jié)果:組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SFN能夠緩解糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜病理改變程度,細(xì)胞排列較糖尿病組整齊,血管擴(kuò)張減輕。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)顯示,SFN干預(yù)后增加了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量,高劑量SFN組改善效果更為顯著。此外,SFN干預(yù)后顯著減少了STZ大鼠視網(wǎng)膜組織和高糖環(huán)境下Müller細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的生成,增強(qiáng)了抗氧化酶(GSH、SOD和CAT)的活性。并且,SFN增強(qiáng)了Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)的聚集和表達(dá),提高了Nrf2下游兩種主要抗氧化劑HO-1、NQO1的表達(dá)。另外,糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織和高糖環(huán)境下的Müller細(xì)胞表達(dá)的NLRP3炎癥小體各組分:NLRP3、cleaved caspase-1 p20、ASC較正常對(duì)照組大鼠顯著增加,而SFN干預(yù)能夠明顯降低NLRP3炎癥小體各組分蛋白表達(dá)。但沉默Müller細(xì)胞Nrf2基因之后,SFN處理對(duì)高糖環(huán)境下細(xì)胞的炎癥指標(biāo)、抗氧化物質(zhì)水平及NLRP3炎癥小體的形成無(wú)顯著影響。結(jié)論:SFN可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路并抑制NLRP3炎癥小體的形成增強(qiáng)高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激能力并減輕炎癥反應(yīng)水平,從而對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變起到一定的保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察及視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量測(cè)大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)變化。B.視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。數(shù)據(jù)以（n=3）。***p＜0.001 VS Control，#p＜0.05 VS STZ。表 2 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞計(jì)數(shù)平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照組 24.00 4.00SFN1 組 23.80 4.44尿病組（STZ 組） 9.40 1.67SFN0.5+STZ 組 13.80 3.27SFN1+STZ 組 17.00 3.394 討論

鼠視網(wǎng)膜組織中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05，，p<0.01）。說(shuō)明糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織炎癥反應(yīng)水平明顯增加，SFN可顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子的釋放。SFN 作為一種抗氧化物質(zhì)，其抗炎的作用可能通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)，這將在論文第三部分詳細(xì)闡述。其次采用試劑盒方法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織的中 GSH 含量，SOD 和 CAT 活性。結(jié)果顯示（圖 2D-F），與正常對(duì)照組相比，SFN1 組大鼠視網(wǎng)膜組織中 GSH 含量，SOD和 CAT 活性無(wú)顯著變化，而糖尿病組（STZ 組）大鼠視網(wǎng)膜組織中 GSH 含量，SOD和 CAT 活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；與糖尿病組（STZ 組）相比，SFN0.5+STZ 組和 SFN1+STZ 組大鼠視網(wǎng)膜組織中 GSH 含量，SOD 和 CAT 活性明顯增加，其中 SFN1+STZ 組差異更為顯著（p<0.01）。說(shuō)明在糖尿病高血糖狀態(tài)下，視網(wǎng)膜組織的抗氧化防御系統(tǒng)遭到了破壞，ROS 的清除能力會(huì)被抑制，SFN處理可增強(qiáng)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的抗氧化能力，在一定程度上其作用呈現(xiàn)劑量依賴性。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋媛;李虹;閆海震;趙倉(cāng)煥;歐仕益;;Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與2型糖尿病氧化應(yīng)激相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2015年10期

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3 李航;任韞卓;劉淑霞;劉青娟;劉品力;周琰;段惠軍;;叔丁基對(duì)苯二酚對(duì)糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷及Nrf2蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2009年10期

本文編號(hào)：2661863