【摘要】：目的應(yīng)用全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing,WES)技術(shù)鑒定1個(gè)中國(guó)Stargardt(stargardt macular dystrophy,STGD)病家系中與疾病相關(guān)的突變,擴(kuò)展現(xiàn)有的致病突變譜,并進(jìn)一步確定基因型-表型相關(guān)性。方法收集中國(guó)STGD病家系和200名正常對(duì)照。記錄先證者及其姐姐的臨床資料,詢問記錄病史及家族史,進(jìn)行眼科一般檢查和特殊檢查,包括眼底彩色照相、黃斑區(qū)相干斷層成像(optical coherence tomography,OCT)及視野檢查。靜脈采集患者及家庭成員外周血,用Blood DNA Kit試劑盒提取DNA并進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)合格后應(yīng)用Illumina HiSeq2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序,并分析其生物流程,進(jìn)行變異檢測(cè)及注釋。通過數(shù)據(jù)位點(diǎn)的整合、過濾、功能預(yù)測(cè)結(jié)合常染色體隱性遺傳模式分析以發(fā)現(xiàn)致病基因突變。運(yùn)用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)家系成員行突變分析,完成一代測(cè)序的確認(rèn)。繼而針對(duì)200名健康對(duì)照通過高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)方法進(jìn)行突變的篩查,進(jìn)一步排除多態(tài)性位點(diǎn)。通過ProtParam工具計(jì)算突變體和野生型蛋白質(zhì)的物理化學(xué)參數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。SMART在線軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域在線分析。HOPE在線軟件用于分析突變的結(jié)構(gòu)效應(yīng)。應(yīng)用健康C57小鼠,進(jìn)行免疫熒光染色和免疫蛋白印跡法(western blot,WB),檢測(cè)上述基因的蛋白表達(dá)水平,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況。分析小鼠視網(wǎng)膜中ABCA4的含量情況。結(jié)果先證者及其姐姐眼底彩色照相可見,眼底形態(tài)以黃斑區(qū)不同程度、范圍的萎縮和眼底黃色斑點(diǎn)分布為特點(diǎn)。黃斑區(qū)OCT可見黃斑區(qū)神經(jīng)上皮厚度變薄。視野檢查顯示中心暗點(diǎn)與局部暗點(diǎn),合并視野缺損。使用WES,鑒定了ABCA4基因中的新的純合突變(NM_000350:c.G3190C,p.G1064R)。該突變?cè)诩蚁抵信c表型共分離。在200個(gè)不相關(guān)的健康對(duì)照中沒有檢測(cè)到該突變,并且在任何數(shù)據(jù)庫(kù)都沒有記錄,說明是一個(gè)新的突變。五種功能預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)該突變?yōu)椤坝泻Α?并且在進(jìn)化過程中高度保守。ABCA4的AAA ATP酶核心存在于氨基酸955至1145,而p.G1064R位于AAA結(jié)構(gòu)域,可能迫使局部骨架形成不正確的構(gòu)象,擾亂局部結(jié)構(gòu),降低ATP酶的活性,從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。ABCA4在小鼠視網(wǎng)膜等眼組織中高度表達(dá),在正常小鼠角膜組織中也有表達(dá)。結(jié)論我們鑒定了STGD位于ABCA4基因的一個(gè)新的致病突變(NM_000350:c.G3190C,p.G1064R)。該基因突變與家系表型共分離,軟件功能預(yù)測(cè)為“有害”,并且在進(jìn)化中高度保守,這都提示其致病性。本研究結(jié)果擴(kuò)增了現(xiàn)有的致病突變譜,并進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)于基因型-表型相關(guān)性的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

結(jié)果的一般情況入中國(guó)血統(tǒng)的 1 個(gè) Stargardt 病家系，對(duì)于家系患者年齡 13 歲，性別男，先證者姐姐 18 歲。否認(rèn)姐均患有 Stargardt 病，父母沒有患病，該譜系表傳（圖 1）。另外收集了 200 個(gè)與該疾病不相關(guān)視力逐漸下降 8 年。臨床表現(xiàn)：眼部檢查視力：裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)，可見雙眼眼瞼無紅腫深度中等，房閃（-），晶狀體透明，雙眼瞳孔圓體輕度混濁。先證者姐姐自述視力嚴(yán)重下降近 1 0.1，雙眼矯正無助。

一例 STGD 家系致病基因的鑒定及在角膜營(yíng)養(yǎng)不良中的潛在作用者及其姐姐的有詳細(xì)的眼底檢查結(jié)果，圖 2 所示，，兩人的眼底檢查結(jié)兩人即出現(xiàn)了眼底萎縮，又出現(xiàn)了眼底黃色斑點(diǎn)。可見先證者及其姐姐黃斑區(qū)萎縮，萎縮的程度范圍形態(tài)各不相同，斑萎縮區(qū)可見色素紊亂及色素變動(dòng)，可見清晰的黃色斑點(diǎn)。先證者姐可見黃斑區(qū)呈“青銅片狀”或“牛眼狀”外觀，顏色黃白相間，可見萎縮，境界明顯。點(diǎn)：先證者及其姐姐均可見明顯的眼底黃色斑點(diǎn)。不但在黃斑萎縮中部視網(wǎng)膜也可發(fā)現(xiàn)黃斑的萎縮。黃色斑點(diǎn)有的類似于針尖樣，有的條狀，可見形狀多種多樣，較為復(fù)雜。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R772.2

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