【摘要】：目的:研究促炎癥消退脂質(zhì)Maresin1在小鼠煙曲霉菌性(Aspergillus fumigatus,AF)角膜炎炎癥反應(yīng)中的作用及作用機制。方法:1.采用角膜基質(zhì)內(nèi)注射煙曲霉菌孢子的方法建立1天、3天、5天小鼠煙曲霉菌性角膜炎動物模型,治療組建模兩小時后球結(jié)膜下注射5ng/5ul的Maresin1,對照組給與等量體積的PBS處理。感染后第1天開始每天給予兩次Maresin1滴眼直到感染結(jié)束,對照組用同樣方法給予PBS滴眼處理。裂隙燈下拍照觀察各組的小鼠角膜感染情況并記錄角膜炎臨床評分。2.采用髓過氧化物酶法(MPO)和免疫熒光法特異性標記中性粒細胞對實驗組和對照組小鼠角膜基質(zhì)中中性粒細胞的募集情況進行檢測。采用PCR、Western Bolt法對實驗組和對照組小鼠角膜中趨化因子CXCL1和炎癥因子IL-10的mRNA含量和蛋白含量進行定量檢測。3.Maresin1或PBS預(yù)處理RAW264.7小鼠巨噬細胞,煙曲霉菌滅活菌絲刺激后,采用PCR和Western Bolt法檢測趨化因子CXCL1和炎癥因子IL-10的mRNA水平和蛋白水平。4.糖原合成激酶GSK3β抑制劑LiCL預(yù)處理RAW264.7巨噬細胞后,經(jīng)過Maresin1或PBS干預(yù),滅活煙曲霉菌菌絲刺激后,Western Blot法檢測磷酸化的糖原合成激酶的蛋白水平,采用PCR法對趨化因子CXCL1和炎癥因子IL-10的mRNA水平進行檢測。結(jié)果:1.與PBS對照組相比,Maresin1干預(yù)組小鼠角膜在煙曲霉菌感染后第三天炎癥反應(yīng)程度減輕,臨床評分下降。Maresin1干預(yù)組小鼠角膜中趨化因子CXCL1的mRNA和蛋白水平分別在感染后第三天和第五天較對照組相比顯著下降。炎癥因子IL-10 mRNA和蛋白水平在Maresin1干預(yù)后的小鼠角膜中于感染后第一天、第三天、第五天較PBS對照組顯著增加。2.中性粒細胞染色顯示Maresin1干預(yù)組小鼠角膜基質(zhì)中中性粒細胞數(shù)目減少。同時,Maresin1干預(yù)組小鼠角膜中MPO數(shù)目較PBS對照組數(shù)目下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.與PBS對照組相比,Maresin1抑制了滅活煙曲霉菌菌絲刺激RAW264.7細胞后的炎癥因子CXCL1的mRNA和蛋白水平,同時增強了炎癥因子IL-10的mRNA和蛋白水平。4.Maresin1預(yù)處理后RAW264.7細胞后,經(jīng)滅活煙曲霉菌菌絲刺激,p-GSK3β的蛋白水平增多。此外,GSK3β抑制劑LiCl預(yù)處理RAW264.7細胞后,Maresin1能夠進一步抑制趨化因子CXCL1的mRNA水平,同時也能進一步促進抗炎因子IL-10mRNA的產(chǎn)生。結(jié)論:促炎癥消退脂質(zhì)Maresin1能夠減輕小鼠煙曲霉菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)并抑制角膜基質(zhì)中中性粒細胞的募集。Maresin1預(yù)處理抑制了滅活煙曲霉菌菌絲刺激巨噬細胞后趨化因子CXCL-1的產(chǎn)生并增強了抗炎因子IL-10的水平。Maresin1可能通過調(diào)控GSK3β的磷酸化狀態(tài)來調(diào)控趨化因子CXCL1和炎癥因子IL-10的表達。
【圖文】：

結(jié)果結(jié) 果2.1 煙曲霉菌菌絲及分生孢子形態(tài)觀察采用平板劃線法在沙式固體培養(yǎng)基上接種煙曲霉菌，，隨后將沙式固體培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng) 3-4 天后可觀察到白色棉花狀的煙曲霉菌菌落（圖 1.A）。此外，煙曲霉菌菌落生長的同時不斷地產(chǎn)生煙曲霉菌分生孢子。收集培養(yǎng) 2-3 天的煙曲霉菌分生孢子之后進行觀察，生長狀態(tài)良好的煙曲霉菌分生孢子呈球形。（圖 1.B）。

圖 2. Maresin1 對小鼠煙曲霉菌性角膜炎的臨床表現(xiàn)和臨床評分的影響。（A-B）為對照組和 Maresin1 干預(yù)組小鼠煙曲霉菌性角膜炎的裂隙燈照相；（C）為對照組和 Maresin1 干預(yù)組角膜炎臨床評分。2.3 Maresin1 抑制了小鼠煙曲霉菌性角膜炎時角膜基質(zhì)中浸潤的中性粒細胞數(shù)目。為了確定促炎癥消退脂質(zhì) Maresin1 對中性粒細胞募集的作用，我們建立了小鼠煙曲霉菌性角膜炎感染第 3 天動物模型，球結(jié)膜下聯(lián)合滴眼給與 Maresin1 干預(yù)，采用免疫熒光和 MPO 法檢測對照組和 Maresin1 干預(yù)組小鼠角膜基質(zhì)中的中性粒細胞數(shù)目。免疫熒光結(jié)果如圖（圖 3.A），紅色代表中性粒細胞表面標記的 NIMP-R14 蛋白，藍色代表 DAPI。結(jié)果表明，與對照組相比，Maresin1 干預(yù)組小鼠角膜基質(zhì)內(nèi)中性粒細胞數(shù)目減少。MPO 結(jié)果如圖所示（圖 3.B，P<0.001），與對照組相比，Maresin1干預(yù)組小鼠角膜基質(zhì)中中性粒細胞數(shù)目減少。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R772.21

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