發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 02:48

【摘要】：目的:視網(wǎng)膜退行性疾病,包括年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)和視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP),是一種嚴(yán)重的視力損傷性疾病。該病主要由視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行性凋亡或壞死引起,目前尚無有效治療方法。研究證明細(xì)胞替代療法可以替代受損的細(xì)胞或營養(yǎng)支持凋亡的細(xì)胞,因此成為最有希望治療視網(wǎng)膜退行性疾病的方法。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(Retinal Progenitor Cells,RPCs),是一種分離于發(fā)育中視網(wǎng)膜組織的一類干/祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞不僅能夠自我更新而且能夠定向分化成視網(wǎng)膜各級細(xì)胞,應(yīng)用更加簡單,無需長時(shí)間誘導(dǎo)過程,更加安全,成為細(xì)胞替代療法中最有希望臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的種子細(xì)胞。然而視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外擴(kuò)增效率和定向分化成神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞是目前研究面臨的主要問題。先前研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞分泌蛋白組中含有神經(jīng)營養(yǎng)因子和活性細(xì)胞因子,可以通過旁分泌作用促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化。眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human eyelid adipose-derived stem cells,HEASCs)做為一種神經(jīng)外胚層來源的自體干細(xì)胞,具有修復(fù)組織損傷的潛能。因此本研究探究了眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖、貼壁和分化的影響,進(jìn)一步通過抗體芯片分析了兩種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分泌蛋白組的差異,初步探索間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分化的因子及機(jī)制。研究方法:利用外植體方法分離和培養(yǎng)了不同年齡眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞,并比較了不同年齡組眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的增殖能力,通過流式細(xì)胞儀、Real-time PCR和細(xì)胞分化能力鑒定和比較了不同年齡組眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物的表達(dá)和多向分化能力的差異。然后分別收集了在神經(jīng)營養(yǎng)因子刺激條件下眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)體外分離的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞,利用MTT、細(xì)胞周期檢測和Real-time PCR評估間充質(zhì)條件培養(yǎng)基對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外增殖和貼壁的影響;細(xì)胞免疫熒光和Real-time PCR檢測了在無外源血清誘導(dǎo)物和有血清誘導(dǎo)情況下實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的影響。為了尋找間充質(zhì)干細(xì)胞促b進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外增殖和分化的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)利用抗體芯片檢測了兩種間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分泌因子的表達(dá)情況;我們選擇差異表達(dá)的細(xì)胞因子Activin A,并觀察Activin A對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖的和分化的影響,從而初步探究參與Activin A對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的信號通路。結(jié)果:利用外植體方法成功提取了不同年齡的眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)過外植體培養(yǎng),3天左右可見少量細(xì)胞從組織周圍爬出,貼壁生長,呈現(xiàn)雙極桿狀,折光性強(qiáng),成纖維樣細(xì)胞形態(tài),3-20天內(nèi)全部組織均可見細(xì)胞生長。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明了年齡對眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞呈副作用,年齡增長HEASCs體外增殖能力減弱;流式細(xì)胞比較表面標(biāo)記物表明,不同年齡眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞均高表達(dá)CD105、CD44、CD73,低表達(dá)CD34、CD45、CD31,而CD90的表達(dá)各年齡段具有顯著差異;體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),隨著年齡的增長HEASCs成骨和成軟骨分化能力下降,而成脂肪分化能力增強(qiáng);視網(wǎng)膜祖細(xì)胞培養(yǎng)在收集的兩種間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中,觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)RPCs細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S和G2期,間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基同時(shí)促進(jìn)RPCs高表達(dá)增殖標(biāo)志物Ki67;在兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用下,RPCs高表達(dá)視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物NF,Recoverin和Rhodopsin,證明了兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特異性分化;在胎牛血清誘導(dǎo)劑存在下,兩種來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基更顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表達(dá)NF,Recoverin和Rhodopsin;抗體芯片檢測結(jié)果表明,兩種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基共檢測到230個(gè)因子表達(dá),其中包括生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞受體因子和炎性因子等;兩種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞共表達(dá)因子109個(gè),只在HEASCs上清液中表達(dá)的因子有62個(gè),只在UMSCs中表達(dá)的因子有59個(gè);抗體芯片結(jié)果顯示,Activin A只在眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中高表達(dá)。在RPCs培養(yǎng)基中添加不同濃度的Activin A,發(fā)現(xiàn)Activin A存在下促進(jìn)RPCs的增殖作用與對照組相比無顯著差異;細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),Activin A存在下可顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分化,顯著性高表達(dá)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性標(biāo)志物,同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)也證明Recoverin和Rhodopsin蛋白高表達(dá);Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明在Activin A刺激視網(wǎng)膜祖細(xì)胞后,p-Akt和p-Erk表達(dá)較未刺激組增高,加入PI3K/AKT抑制劑后p-Akt、p-Erk、Recoverin和Rhodopsin的表達(dá)均顯著下降,說明PI3K/AKT/ERK信號通路參與Activin A對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化調(diào)控作用。結(jié)論:通過外植體方法成功提取了不同年齡眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞,隨著年齡增長,眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力減弱,眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成軟骨分化能力減弱,而成脂分化能力不受影響。利用眼眶周脂肪和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可以促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外增殖、貼壁和向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分化�？贵w芯片發(fā)現(xiàn)眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中高表達(dá)Activin A,當(dāng)Activin A存在下,可以促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞顯著分化,并且PI3K/AKT/ERK信號通路參與Activin A促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的分化過程的調(diào)控。
【圖文】：

外植體法分離眼眶周脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

HEASCs體外生長增殖情況
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2655474