【摘要】：糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見且最具破壞性的并發(fā)癥之一,影響約1/3的糖尿病患者,是導(dǎo)致勞動(dòng)年齡人口和老年人口視力下降的重要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展及惡化與糖尿病的長(zhǎng)期病程、血糖控制差等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。當(dāng)暴露于高糖環(huán)境中時(shí),視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPEs)在形態(tài)和功能上都會(huì)發(fā)生顯著的改變,表現(xiàn)為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不完全清楚。巨核細(xì)胞性白血病因子1(MKL1)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,又被稱作為骨髓來源的急性白血病因子(MAL),或者是心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MRTF-A)。我們的研究發(fā)現(xiàn),用25m M葡萄糖處理過的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)生了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程,其特征表現(xiàn)為E-鈣粘蛋白(由CDH1編碼)表達(dá)下調(diào)的同時(shí)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(由ACTA2編碼)的表達(dá)上調(diào)。高糖環(huán)境誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中,同時(shí)伴隨著MKL1表達(dá)增多并且在細(xì)胞核富集增強(qiáng)。相反,當(dāng)使用小片段干擾核苷酸(si RNA)敲除或小分子化合物CCG-1423抑制MKL1后,高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程被抑制。在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)高糖環(huán)境刺激的應(yīng)答中,另一個(gè)有趣的現(xiàn)象是,MKL1介導(dǎo)了間充質(zhì)標(biāo)志物賴氨酰氧化酶(LOX)的轉(zhuǎn)錄激活。從機(jī)制上講,轉(zhuǎn)錄因子AP-1與MKL1相互作用,并且招募MKL1到LOX的近端啟動(dòng)子上,通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來促進(jìn)LOX的轉(zhuǎn)錄激活。最后,使用si RNA敲低LOX或通過氨基丙腈抑制LOX時(shí),可消除高糖環(huán)境誘導(dǎo)的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。結(jié)論,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MKL1通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)控LOX的轉(zhuǎn)錄激活,從而介導(dǎo)了高糖環(huán)境誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。
【圖文】：

圖 2：高葡萄糖水平誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮發(fā)生上皮間充轉(zhuǎn)化的過程中，MKL1 發(fā)揮了重要的作用（A）RPEs 通過 siRNA 干擾 MKL1 后，給予高濃度的葡萄糖處理，，48h 后通qPCR 方法檢測(cè) MKL1、CDH1、ACTA2 基因的表達(dá)量（B）RPEs 通過 siRNA 干擾 MKL1 后，給予高濃度的葡萄糖處理，48h 后通免疫印跡方法檢測(cè) MKL1、E 鈣粘蛋白、α-sma 蛋白的表達(dá)量（C）ChIP 實(shí)驗(yàn)，給予 SNAIL 抗體，觀察 SNAIL 與 CDH1 啟動(dòng)子結(jié)合的情（D）ChIP 實(shí)驗(yàn)，給予 SMAD3 抗體，觀察 SMAD3 與 ACTA2 啟動(dòng)子結(jié)合的況（E）RPEs 給予高濃度的葡萄糖同時(shí)給與 MKL1 的抑制劑 CCG-1423 后，通qPCR 方法檢測(cè) CDH1、ACTA2 基因的表達(dá)水平（F）RPEs 給予高濃度的葡萄糖同時(shí)給與 MKL1 的抑制劑 CCG-1423 后，通

圖 3：MKL1 通過激活 LOX 轉(zhuǎn)錄來應(yīng)答高糖對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的刺激（A）以 MKL1 或 SCR 為靶點(diǎn)的 siRNA 干擾 RPEs 后，予以高糖處理 48h。通過 qPCR 方法檢測(cè) LOX 基因的表達(dá)水平（B）處理同 A，通過免疫印跡方法檢測(cè) LOX 蛋白的表達(dá)水平（C）使用 CCG-1423 或不使用 CCG-1423 對(duì) RPEs 進(jìn)行高糖處理。通過 qPCR方法檢測(cè)基因的表達(dá)水平（D）處理同 C。通過免疫印跡方法檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平（E）將不同長(zhǎng)度的 LOX 啟動(dòng)子構(gòu)建體，含有 MKL1 或不含有 MKL1，轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞中。報(bào)告基因激活試驗(yàn)通過蛋白濃度和 GFP 熒光值來校正（F）對(duì) RPEs 予以高糖（25mM）處理，并在指定的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。使用抗MKL1 抗體進(jìn)行 ChIP 實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R774.1

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本文編號(hào)：2648968