【摘要】：【目的】變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一種常見的上呼吸道慢性非感染性炎性疾病。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)作為與mRNA競爭的內(nèi)源性RNA在多種疾病中發(fā)揮重要作用。本研究旨在通過構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)路,綜合分析circRNA在AR鼻黏膜中的表達和作用機制。【方法】本實驗利用第二代高通量測序技術(shù),分析AR和對照鼻黏膜組織circRNA、miRNA和mRNA的表達譜。著重分析鼻黏膜中circRNA表達及特征,并以差異倍數(shù)大于1.5、p0.05為標準篩選出大量差異表達(differential expression,DE)的circRNA,根據(jù)總的差異circRNA富集結(jié)果,按照p值排序,提取p值較小的前300個miRNA-circRNA相互作用對,繪制circRNA-miRNA靶標互作網(wǎng)絡(luò)圖。以同樣的標準,篩選出DEmiRNA和DEmRNA。根據(jù)生物信息學(xué)分析miRNA-targets(circRNA或mRNA)相互作用和表達值相關(guān)性檢測,構(gòu)建基于ceRNA原理的DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA網(wǎng)絡(luò)。對網(wǎng)絡(luò)中有ceRNA關(guān)系的編碼基因使用注釋及可視化數(shù)據(jù)庫,得到基因本體(gene ontology,GO)功能注釋以及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集情況。最后,我們對hsa_circ_0008668、hsa_circ_0029853、circTRIQK和circRNA_01002進行了Sanger測序和qRT-PCR定量分析。【結(jié)果】對測序結(jié)果分析,共預(yù)測出30 936個circRNA,其中已知circRNA有12 376個,新發(fā)現(xiàn)18 560個。在鼻黏膜circRNA類型中正義外顯子最多,circRNA轉(zhuǎn)錄本中的外顯子數(shù)量主要在1-7個之間,長度大多集中在200-400 bp之間和2000 bp區(qū)域。AR鼻黏膜中篩選出DEcircRNA共264個,其中上調(diào)120個,下調(diào)144個。異常表達miRNA和mRNA分別有28個和228個。ceRNA網(wǎng)絡(luò)中DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA關(guān)系對共有64個,由11個circRNAs、17個miRNAs、29個mRNAs構(gòu)成。GO和KEGG通路富集顯示網(wǎng)絡(luò)中基因涉及Wnt信號通路、TNF、炎癥反應(yīng)和PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)等多種與AR相關(guān)的機制通路。Sanger測序和qRT-PCR定量分析,結(jié)果顯示hsa_circ_0008668、circTRIQK在AR中表達上調(diào),hsa_circ_0029853、circRNA_01002在AR中表達下調(diào),與測序結(jié)果一致。鼻黏膜中circRNA與AR顯著相關(guān)。【結(jié)論】circRNA與AR顯著相關(guān),circRNA的miRNA分子海綿效應(yīng)在AR的發(fā)病中可能扮演重要作用。circRNA可能為AR精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新方向。
【圖文】：

圖 1.A. 檢測到的 circRNA 中，已知 12376 個，新發(fā)現(xiàn) 18560 個；B. circRNA 產(chǎn)物分布的盒狀圖。歸一化后，6 個樣本間 log2 比值的分布基本相同；C. 顯示 circRNA 在染色體上的表達分布；D. circRNA 的 RPM（spliced reads per millon）密度分布。（3）根據(jù) circRNA 基因結(jié)構(gòu)分析 circRNA 類型，所鑒定的 circRNA 中，反義鏈 1119 個，正義鏈 29335 個，其中正義外顯子最多，占 93%（圖 2A）。此外，circRNA 轉(zhuǎn)錄本中的外顯子數(shù)量主要在 1-7 個之間（圖 2B）。circRNA 序列長短分析表明，，circRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大多在 200-400 bp 和>2000 bp 區(qū)域（圖 2C）。分層聚類結(jié)果表明，樣品間的差異表達的 circRNA 表達模式是可以區(qū)分的（圖 2D）。

圖 2. circRNA 的特點。A. circRNA 類型；B. circRNA 外顯子數(shù)的分布；C. circRNA 序列長度；D. circRNA 的熱圖和層次聚類，紅色和藍色分別表示高、低相對表達，每一個 RNA 都用一排彩色盒子表示，每一個樣本目前都用一列表示。（4）以 p<0.05、差異倍數(shù)>1.5 為標準，發(fā)現(xiàn)共有 264 個 circRNAs 表達有差異，其中上調(diào) 120 個，下調(diào) 144 個（補充的表 1）。circRNA 可作為 miRNA 分子海綿，解除其抑制靶向基因表達的作用。為了探索 miRNA 與 circRNA 之間可能的相互作用，我們根據(jù)總的差異 circRNA 富集結(jié)果，按照 p 值排序，提取 p值較小的前 300 個 miRNA-circRNA 相互作用對，利用 R network 軟件包繪制circRNA-miRNA 靶標互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R765.21

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本文編號：2640901